不同灸法对免疫抑制兔T细胞亚群、NK细胞、B细胞的影响

单增天，吴爱花，田岳凤，李雷勇，王 军

（1.山西中医学院，山西太原030024； 2.山西医科大学第二医院，山西太原030001）

实Expe验rim en中tal S医tudy药 on T学CM

不同灸法对免疫抑制兔T细胞亚群、NK细胞、B细胞的影响

单增天1，吴爱花1，田岳凤1，李雷勇2，王 军1

（1.山西中医学院，山西太原030024； 2.山西医科大学第二医院，山西太原030001）

“实验”虽然是现代科学研究常用的方法，然在我国却自古有之。古代学者王冲说“等类众多，行事比肩，略举较著，以定实验也”，颜之推说“昔在江南，不信有千人帐，及来河北，不信有二万斛船，皆实验也”，大凡此义均与现代科学意义上的experiment相通。照此，传统中医药学并非只是经验之学，而更充满实验的思想和方法。实验中医药学，将现代实验科学的方法和传统中医药学的实验方法融合起来，开拓现代实验生物学、医学和药物科学的新领域。

目的：观察不同灸法对环磷酰胺所致免疫抑制兔T细胞亚群、NK细胞、B细胞的影响。方法：将大耳白兔50只随机分成5组，分别为空白组、模型组、隔药饼灸组、艾灸组、假药饼灸组。除空白组外，其他4组均腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg，连续造模7 d，造成免疫抑制模型。3个治疗组分别给予隔药饼灸、艾灸、假药饼灸治疗，隔日灸，共灸10次。治疗结束次日静脉取血，ELISA法检测CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、B细胞值。结果：与空白组比较，模型组CD3+明显降低、CD8+明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，隔药饼灸组CD3+升高、CD8+降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；艾灸组和假药饼组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞及B细胞值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：隔药饼灸能有效地调节因环磷酰胺所致的CD3+下降、CD8+升高。

环磷酰胺；免疫抑制；隔药饼灸；T细胞亚群；NK细胞；B细胞

艾灸在我国已有两千多年的历史，是我国传统医学的重要部分。大量实验研究证实艾灸能够有效地调节机体免疫力，使处于免疫抑制状态的机体恢复正常状态。隔药饼灸是将药物、艾灸、穴位三者有机结合作用于机体，本文从这一角度研究隔药饼灸对免疫抑制兔机体T细胞亚群、NK细胞、B细胞的影响，并与艾灸组及假药饼组相比较，为艾灸提高机体免疫力低下提供明确的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 50只大耳白兔来自北京昌扬西山养殖场［动物合格证号：SCXK（京）2011-0010］，体质量（2.5±0.3）kg，雌雄不限。饲养温度和湿度分别为20℃～25℃、50%～70%。

1.1.2 药物与试剂 清艾条：江苏盱眙华佗中药厂（批号：Z32020153）；注射用环磷酰胺（CTX）：200mg/瓶，山西普德药业股份有限公司（批号：H14023686）；0.9%NaCl注射液500mL：石家庄四药有限公司。酶联免疫试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模 将50只大耳白兔随机分为5个组，每组10只，分别为空白组、模型组、隔药饼灸组、艾灸组和假药饼灸组。造模前实验动物适应性饲养1 w，除空白组外其余4组均腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg（环磷酰胺用0.9%NaCl注射液稀释），每天上午注射给药，连续7 d，制造免疫抑制模型，空白组注射等量0.9%NaCl注射液。

1.2.2 穴位选择 神阙、关元、足三里（双）、脾俞（双）、肾俞（双）。穴位定位参照林文注主编《实验针灸学》［1］常用动物穴位定位法及拟人比照法。

1.2.3 药物制作 按六味地黄丸组方剂量将熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、丹皮、茯苓打碎成粉末，过120目筛备用，用75%酒精将药物粉末调匀制作药饼，药饼均用模具制成，直径1 cm，厚0.3 cm；假药饼原料采用面粉，制作方法与药饼相同。

1.2.4 施灸方法 施灸前将动物穴位处皮毛剪去，将其固定于兔台。将江苏盱眙华佗中药厂的清艾条折断，取出艾绒，制成大小相等，底径0.8 cm、高0.5 cm的圆锥形艾柱，置于药饼和假药饼上，以线香点燃，燃尽更换，每穴连灸3壮，隔日灸，共灸10次；艾灸组将3壮艾柱量的艾绒制作成小艾条，置于穴位上施灸。隔日灸，共灸10次。

1.3 样品采集及指标观察

治疗结束次日，动物麻醉，取腹腔静脉血，离心，抽取血清备用。ELISA法检测：CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞、B细胞值。

1.4 统计学方法

2 结果

与空白组比较，模型组、假药饼组CD3+明显降低、CD8+明显升高，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）；CD4+、NK、B细胞3项指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，隔药饼灸组CD3+升高、CD8+降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

3 讨论

环磷酰胺可杀伤淋巴细胞，尤其对早期NK细胞有明显抑制作用；T、B细胞是重要的淋巴细胞，对环磷酰胺也最为敏感，可抑制T淋巴细胞转化成淋巴母细胞，抑制B细胞的特异性抗体反应。大量动物实验研究证明，环磷酰胺是一种常用的免疫抑制剂，对动物机体可产生中等至严重的免疫抑制作用，抑制机体的体液免疫和细胞免疫反应，造成免疫功能的低下［2-3］。因此，在实验研究中常利用这一作用制作免疫抑制模型。环磷酰胺是一种强免疫抑制剂，主要免疫抑制机制为：可杀伤淋巴细胞，尤其早期对B细胞、NK细胞作用明显；抑制T淋巴细胞对抗原刺激后的淋巴母细胞转化；抑制B细胞的特异性抗体反应［4］。CD3+、CD8+、NK细胞等都是免疫细胞中重要的检测指标。T淋巴细胞主要参与细胞免疫，CD3+是成熟T细胞的表面标志，其数量代表细胞免疫的总体水平；CD4+主要表达于辅助T细胞，CD8+表达于细胞毒性T细胞上，二者对免疫功能的判断有重要作用。NK细胞是机体重要的一类免疫细胞，参与机体免疫调节和自身免疫性疾病。B细胞是体内唯一能产生抗体的细胞，外周血B细胞约占淋巴细胞总数的10%～20%，在机体内发挥体液免疫功能。

表1 不同灸法对免疫抑制兔血清CD、NK及B的影响 （±s）

表1 不同灸法对免疫抑制兔血清CD、NK及B的影响 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与空白组比较，2）P＜0.01

组别 n CD3+（U/ml）CD4+（U/ml）CD8+（U/ml）NK（nmol/L） Bc（ng/L）空白组 10 42.48±4.52 23.61±0.90 8.94±1.47 84.79±10.64 587.00±117.81模型组 10 32.00±8.322）23.37±2.25 10.76±1.082）92.21±10.60 632.67±140.81隔药饼组 10 42.73±4.721）23.76±1.53 9.01±0.661）91.47±16.21 647.00±108.07艾灸组 10 39.79±5.40 23.70±3.16 9.67±1.51 91.76±21.84 704.59±213.95假药饼组 10 32.48±11.772）24.49±2.23 10.52±1.332）88.16±10.04 660.19±149.20 F值 4.80 0.36 4.31 0.47 0.77 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

神阙与关元均为任脉上穴位，神阙穴可健脾和胃、强壮保健、祛病延年，关元穴培补元气；足三里为足阳明胃经之合穴，根据《内经》“合治内腑”的理论，凡六腑之病皆可用之，具有理脾胃、调气血、补虚损之功效，灸足三里，可强身健体，延缓衰老；脾俞、肾俞为脾肾两脏之背俞穴，气血汇聚于此，长灸之可健脾益气、滋阴补肾。研究表明，艾灸足三里穴、关元穴通过增加NK、NKT细胞数量，改善训练小鼠的细胞免疫功能［5］。早期研究发现隔药饼灸健康老年人大椎等穴，发现艾灸组T细胞亚群比例得到调整，CD3+、CD4+百分率增高，CD4+/CD8+比率也随之升高，治疗前后差异有显著意义［6］。艾灸督脉穴可延缓胸腺和脾脏的萎缩和退化，纠正T细胞亚群比例失衡的状态［7］。

六味地黄丸为滋补肾阴的经典名方，方中重用熟地黄为君药，滋阴补肾、填精益髓，有大补真阴之功效；用补肝养肾而涩精的山萸肉和健脾固肾而固精的山药为臣药，三味补药相配伍有滋肾、养肝、益脾的作用；佐以泽泻利水渗湿、泻肾火，防熟地之滋腻恋邪；丹皮清泻相火，凉肝而泻阴中伏火，制山萸肉之温涩；茯苓渗湿健脾，既助山药补脾，又助泽泻利水，且防熟地滋腻有碍脾胃运化。六味地黄丸是中医滋补肾阴的代表方，临床既可增强机体免疫力，又可抑制免疫反应［8］。六味地黄汤对神经内分泌免疫调节网络具有调节和恢复平衡的作用，从汤剂中逐步分离获得免疫活性部位CA4，再分离纯化得到CA4-3，其是免疫活性多糖，B细胞是其直接作用的主要靶细胞之一，表明六味地黄汤中的酸性多糖是该复方发挥免疫调节作用的重要物质基础之一［9］。六味地黄软胶囊可改善环磷酰胺致成年及幼年小鼠免疫功能低下，表现在改善T细胞增殖能力，提高T细胞数量，尤其是CD8+细胞，明显提高脾细胞天然杀伤活性，能明显降低迟发型超敏反应等。说明六味地黄软胶囊能增强机体的防御功能，抵御外邪入侵［10］。药理研究证实，它可通过调节T细胞亚群、NK细胞、B细胞的功能，从而改善机体免疫功能［11］。

隔药饼灸是临床常用灸法之一，是将中药与艾灸有机结合的一种方法，具有艾灸、药物、腧穴三重效应，通过艾灸的温热作用促进皮肤对滋阴补肾药物的吸收，经经络传输从而发挥药物归经之效能。我们十余年的临床研究结果充分表明隔药饼灸对机体免疫功能的良好调节作用［12-13］。

本实验结果表明，造模后CD3+明显低于空白组、CD8+明显高于空白组（P＜0.01），表明腹腔注射环磷酰胺造模成功。隔药饼灸神阙、关元、足三里（双）、脾俞（双）、肾俞（双）后，免疫抑制兔血清中CD3+含量明显回升，CD8+含量明显降低，表明隔药饼灸通过调节CD3+、CD8+含量达到提高免疫抑制兔的免疫功能。艾灸组、假药饼灸组与模型组比较各项指标差异无统计学意义，说明艾灸组、假药饼灸治疗效果不佳。然而不同灸法对CD4+、NK细胞、B细胞3项指标无明显影响，同时，艾灸组的变化也不明显，出现这一问题是与艾灸量有关？还是样本含量不够大？这将是我们下一步研究的重点内容。

［1］林文注，王佩.实验针灸学［M］.上海：上海科学技术出版社，1994：283-287.

［2］周立峰，邱玉华，程钢，等.圣愈汤对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠T细胞亚群和细胞因子的影响［J］.现代实用医学，2009，21（8）：808-810.

［3］王洪武，贾亮亮，徐媛青，等.淫羊藿总黄酮对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用［J］.天津医药，2010，38（12）：1 068-1 071.

［4］张长城，姜美杰，赵海霞，等.竹节参总皂苷对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影响［J］.中成药，2011，33（7）：1 134-1 138.

［5］容贤冰，邓武装，蒋晓明，等.艾灸足三里穴与关元穴对训练小鼠免疫功能的影响［J］.重庆医学，2014，43（17）：2 161-2 163.

［6］赵粹英，陈汉平，居贤水，等.隔药饼灸延缓衰老的临床和免疫学机理研究［J］.中国针灸，1998，18（1）：5-7

［7］高希言，王燕.艾灸督脉穴对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠免疫功能的影响［J］.中国针灸，2004，24（7）：46-48.

［8］刘妍，王蕾，赵晖，等.六味地黄和金匮肾气丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠淋巴细胞亚群和NK细胞的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15（4）：42-47.

［9］齐春会，付艳荣，张永祥，等.六味地黄多糖CA4-3对小鼠B细胞功能的作用［J］.中国药理学通报，2001，17（4）：469-472.

［10］周晓棉，曹春阳，曹颖林.六味地黄软胶囊对成年及幼年免疫低功小鼠特异性免疫功能的影响［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（3）：213-216.

［11］李家伦，雷世庸.六味地黄汤对免疫功能低下小鼠的药理作用［J］.中国医药指南，2008，6（16）：13-14.

［12］田岳凤，靳聪妮，李雷勇，等.隔药饼灸对红细胞免疫黏附活性的影响［J］.中医药临床杂志，2007，19（6）：598-599.

［13］田岳凤，李雷勇，王军，等.隔药饼灸对不同年龄健康人红细胞CD58表达的影响［J］.中国针灸，2010，30（11）：933-935.

（编辑：张世霞）

Effect of differentmoxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits

Shan Zengtian1，Wu Aihua1，Tian Yuefeng1，Li Leiyong2，Wang Jun1
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi030001）

Objective：To observe the effect of different moxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits induced by cyclophosphamide.Methods：50 rabbits were random ly divided into blank group，model group，cake-separated moxibustion group，moxibustion group，counterfeitmoxibustion group with 10 in each group.In addition to the blank group，the other groupswere injected with cyclophosphamide（60mg/kg）for sequential 7 days tomake immunosuppression model.Cake-separated moxibustion group，moxibustion group and counterfeitmoxibustion group were given moxibustion 10 times respectively once every other day.Venous blood was taken from the next day after treatment and CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells of serum were tested by ELISA.Results：Compared with blank group，CD3+was significantly decreased（P＜0.01）and CD8+was apparently increased（P＜0.01）in model group.Compared with model group，CD3+was significantly increased（P＜0.01）and CD8+was apparently decreased（P＜0.01）.in cake-separated moxibustion group the difference in CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells betweenmoxibustion group and counterfeitmoxibustion group was not statistical significance.Conclusions：Cake-separated moxibustion can effectively regulate CD3+，CD8+level induced by cyclophosphamide.

cyclophosphamide；immunosuppression；cake-separated moxibustion；T cell subsets；NK cells；B cells

R285

A

1671-0258（2016）01-0016-03

国家自然科学基金面上项目（81373742）

单增天，在读硕士，E-mail：m13233639635_1@163.com

田岳凤，教授，博士生导师，E-mail：tyfsx@163.com