结核分枝杆菌核酸检测在矽肺结核患者中的应用价值

杨晓丽 李月 陈东进 史文韬 李建军



结核分枝杆菌核酸检测在矽肺结核患者中的应用价值

杨晓丽 李月 陈东进 史文韬 李建军

目的 评价核酸检测法在矽肺结核患者中的临床应用价值。方法 选取2015年1—12月在北京京煤集团总医院尘肺与结核病科住院的165例诊断为矽肺结核患者作为病例组；以同时期住院的90例矽肺患者作为对照组。留取研究对象痰标本用于检测。分别应用痰涂片显微镜检法、固体培养法和核酸检测法对研究对象的痰液标本进行检测，并对检测结果进行比较。结果 以固体培养检测结果作为标准，核酸检测法检测病例组的敏感度为94.7%(36/38)，特异度为81.1%(103/127)，阳性预测值为60.0%(36/60)，阴性预测值为98.1%(103/105)；以痰涂片法为标准，核酸检测法检测病例组的阳性预测值为55.0%(33/60)，阴性预测值为100.0%(105/105)，敏感度为100.0%(33/33)，特异度为79.5%(105/132)。与固体培养法和痰涂片法为标准，核酸检测法检测对照组的特异度均为96.7%(87/90)。病例组中，核酸检测法检测阳性率为36.4%(60/165)，高于固体培养法的23.0%(38/165)和痰涂片法的20.0%(33/165)，差异有统计学意义(χ2=12.85，P<0.05)；对照组中，核酸检测法检测阳性率为3.3%(3/90)，其他方法检测阳性率为0.0%。结论 在矽肺结核患者中，核酸检测对Mtb有较高的敏感度和特异度，对Mtb快速检测及辅助诊断具有较高的临床应用价值。

矽肺结核； 分枝杆菌,结核； 核酸

肺结核是尘(矽)肺常见的并发症，合并肺结核是矽肺患者的直接死亡原因之一[1-3]。目前，尘(矽)肺合并肺结核的主要诊断依据是胸部X线摄片和痰液Mtb的检查。但由于矽肺患者胸部X线摄片检查结果的多变性和不确定性，使痰液Mtb检查结果成为矽肺患者Mtb感染和结核病复发确诊的直接病原学证据[4]。我国常规应用的结核病实验室诊断方法，如涂片显微镜检查，敏感度较低。虽然固体培养具有较高的敏感度，但至少需要3～8周的时间，耗时较长[5]。现有的结核病实验室诊断金标准均不能满足临床早期、快速诊治的需要，可能延误诊断和治疗。开发灵敏度高、耗时短、成本低廉并易普及的检测方法成为大势所趋[6]。Mtb核酸检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法)对Mtb的检测在速度上较传统培养方法具有明显的优势。本研究用Mtb核酸检测试剂盒对矽肺结核患者痰液标本中的Mtb核酸进行检测，并对该法的特异度、敏感度及准确性进行评估。

对象和方法

1.对象：选取2015年1—12月在北京京煤集团总医院尘肺与结核病科住院的165例诊断为矽肺结核患者作为病例组；均为男性，年龄38～90岁。以同时期住院的90例矽肺患者作为对照组；均为男性，年龄40～86岁。全部患者的尘肺诊断均依据文献[7]确诊分期；结核病的诊断标准参照文献[8]。留取研究对象痰标本，共255份，均严格按照《结核病诊断实验室检验规程》操作，对样本(痰涂片显微镜检法、固体培养法和核酸检测法三项检查样本均为同一份标本)进行检测。

2.试验材料：Mtb核酸检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法；EasyNAT®TB-CPA)，购自杭州优思达生物技术有限公司，产品标准编号为YZBZ/国0528-2014；最低检出量：102个菌/ml [国家参考品(S2)]。固体培养的培养管购自珠海贝索生物技术有限公司，产品标准编号为YZB/粤 0116-2013。

3.痰涂片显微镜检查和固体培养检测：痰涂片显微镜检查采用萋尼染色法，固体培养采用简单法。

4.核酸检测：采用Mtb核酸检测试剂盒，对临床采集的痰标本进行样本处理及DNA提取、恒温扩增、检测。首先，标本经过液化及洗涤后进行DNA提取，在含沉淀物的离心管中加入40 μl DNA提取液，震荡或移液器吹打混匀，沸水浴(95～100 ℃)10 min，冷却至室温；以12 000 r/min、离心半径5.7 cm，离心10 min，吸取上清液作为模板备用。然后，恒温扩增设置阳性及阴性对照。管中加入15 μl复溶缓冲液，再滴加20 μl石蜡油，室温静置2～3 min，使玻璃化试剂充分溶解。取1管反应液加入4 μl ddH2O混匀，作为阴性对照。在其他反应液中加入DNA模板或直接吸取阳性对照4 μl，用移液器吹打均匀后盖紧。将反应管以4100 r/min，离心半径5.7 cm，瞬时离心3～5 s。再将反应管置恒温金属浴上，63 ℃温浴60 min。将上述扩增后的反应管放入核酸检测装置内芯中，合上核酸检测装置内芯后将其装入装置外盒并关闭。计时15～30 min进行结果判读。

根据试纸上质量控制线(C线)和检测线(T线)的出现与否判读检测结果，即：T线出现代表检测到Mtb的DNA；T线未出现而C线出现，代表未检测到Mtb的DNA；T线和C线均未出现，代表检测失效，需要重复检测。试剂盒包括内参系统，用以检测扩增试剂失效、仪器故障、样品中是否含有扩增抑制物。外部控制用于检测扩增试剂和一次性核酸检测装置故障及检测扩增试剂或环境是否被污染。

5.统计学分析：应用 SPSS 19.0软件进行统计学处理，以固体培养及痰涂片法为标准，对核酸检测法进行敏感度、特异度及阳性预测值、阴性预测值分析；应用χ2检验对痰涂片法、固体培养法、核酸检测法在矽肺结核患者中检测效果进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.核酸检测法与固体培养法比较：以固体培养法作为标准，核酸检测法检测病例组的敏感度为94.7%(36/38)；特异度为81.1%(103/127)；阳性预测值为 60.0%(36/60)，阴性预测值为98.1%(103/105)。两种方法的一致率为84.2%(139/165)，其中有2例患者固体培养与核酸检测的阳性结果不一致，见表1。对照组中，核酸检测法检测3例阳性，固体培养法未检测到阳性病例，核酸检测法的特异度为96.7%(87/90)

表1 核酸检测法与固体培养法和痰涂片法检测165例矽肺结核患者结果的对比

2．核酸检测法与痰涂片法比较：以痰涂片法为标准，核酸检测法检测病例组的敏感度为100.0%(33/33)；特异度为79.5%(105/132)；阳性预测值为55.0%(33/60)；阴性预测值为100.0%(105/105)，见表1。对照组中，核酸检测法检测到3例阳性，固体培养法未检测到阳性病例，核酸检测法的特异度为96.7%(87/90)。

3.检测效果比较：病例组中，核酸检测法检测阳性率为36.4%(60/165)，固体培养法检测阳性率为23.0%(38/165)，痰涂片法检测阳性率为20.0%(33/165)，核酸检测法检测阳性率高于其他检测方法，差异有统计学意义(χ2=12.85，P<0.05)；对照组中，核酸检测法检测阳性率为3.3%(3/90)，其他方法检测阳性率为0.0%。

讨 论

矽肺结核患者通常占矽肺患者的5%～35%[9]。矽肺结核患者痰中变异的L型 Mtb、抗酸染色呈阴性及肺部严重纤维化、支气管扭曲变形致痰液引流不畅均可造成结核病的漏检及误诊[10]。本研究核酸检测的靶基因为Mtb复合群特异性IS6110插入序列，其为国际公认的Mtb复合群的特征序列，仅存在于Mtb复合群基因组中。核酸检测与传统培养法比较，时间缩短，特异性好，并且设有内参系统可以监控假阴性，避免试剂及环境被污染。

本研究显示，与传统的痰涂片、固体培养比较，核酸检测阳性率增高。以固体培养法为标准，核酸检测法的灵敏度为94.7%，特异度为81.1%，阳性预测值为60.0%，阴性预测值为98.1%，总一致性为84.2%。以痰涂片法为标准，核酸检测法的敏感度为100.0%，特异度为79.5%，阳性预测值为55.0%，阴性预测值为100.0%。而冯庆芳等[11]发现，Mtb荧光定量PCR法与分离培养法的阳性一致性为100.00%，阴性一致性为98.61%，总一致性为99.01%，高于本研究结果。究其原因，考虑与实验方法自身局限性有关，也不排除与研究对象自身因素不同有关。矽肺患者由于自身抵抗力和防御机能的下降，加之二氧化硅对Mtb活力和毒性的增强作用；同时，肺组织的缺血和缺氧等因素有利于Mtb的生长，其肺内长期生存的Mtb可产生适应性改变，在形态、毒力、抗原性及药物敏感性方面发生变异[12]。

结果显示，在涂阴患者中有部分患者核酸检测阳性，这部分肺结核患者就可能漏诊，而此时核酸检测对于患者的早期辅助诊断、治疗进行了补充。菌阴肺结核占全部肺结核的40%～60%。菌阴肺结核患者如果不给予治疗，将有近1/2的患者发展为涂阳，成为新的传染源[13]。结核病的早期诊断及其耐药性的检测，对于很好地控制耐药结核病的传播具有十分重要的意义[14]。而单纯矽肺患者中以固体培养及痰涂片法为标准，核酸检测的特异度均为96.7%，在痰涂片、固体培养检测为阴性的患者中仍有患者核酸检测阳性，且对这些患者进行重复试验均为阳性，充分印证了在矽肺结核的辅助诊断中核酸检测的特异度较高。值得注意的是，由于笔者所在科室目前尚不能进行菌种鉴定，故本研究中不排除有非结核分枝杆菌感染患者的可能。

总之，核酸检测是一种速度快、敏感度高、特异度高的Mtb感染的辅助诊断方法，在矽肺结核患者中具有较高的临床应用价值，可以降低漏诊率，使患者尽早进行有效的抗结核药物治疗，改善患者生存质量，减少矽肺与结核病的协同作用，最终降低患者死亡率。同时，核酸检测存在一定局限性，不能判断患者标本中是否为活菌。而且，本法为定性检测，不能反应样本中Mtb的具体水平。

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(本文编辑：李敬文)

Application ofMycobacteriumtuberculosisnucleic acid detection in silicotuberculosis patients

YANGXiao-li,LIYue,CHENDong-jin,SHIWen-tao,LIJian-jun.

DepartmentofPneumoconiosisTuberculosis,GeneralHospitalofJingmeiGroup,Beijing102308,China

CHENDong-jin,Email:chendj0317@sohu.com

Objective To evaluate the clinical application of nucleic acid detection in silicotuberculosis patients. Methods 165 patients, who were diagnosed as silicosis tuberculosis in the department of Pneumoconiosis Tuberculosis, General Hospital of Jingmei Group between January to December in 2015, were selected as case group. 90 silicosis patients detected in the same period of time were selected as control group. Sputum smear microscopy, solid culture method and nucleic acid detection method were used to detect Mycobacterium in patient sputum samples and the results were compared. Results Using the results of solid culture test as golden standard, the sensitivity of nucleic acid detection was 94.7% (36/38); specificity was 81.1% (103/127); positive predictive value was 60.0% (36/60) and negative predictive value was 98.1% (103/105) in the case group. With sputum smear method as standard, the nucleic acid detection got the results of positive predictive value: 55.0% (33/60), negative predictive value: 100% (105/105), sensitivity: 100% (33/33) and specificity: 79.5% (105/132). Combining solid culture method and sputum smear method as standard, the specificity of nucleic acid detection in the control group was 96.7% (87/90). In the case group, the positive rate of nucleic acid detection method was 36.4% (60/165), which was significantly (χ2=12.85,P<0.05) higher than solid culture method of 23.0%(38/165)and sputum smear method of 20.0% (33/165). In the control group, the positive rate of nucleic acid detection method was 3.3% (3/90), compared with the other methods with positive rates of 0. Conclusion In patients with tuberculosilicosis, nucleic acid detection has high sensitivity and specificity to Mtb. It is a valuable method in clinical Mtb rapid detection and assist diagnosis.

Silicotuberculosis；Mycobacteriumtuberculosis； Nucleic acids

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.009

102308 北京京煤集团总医院尘肺与结核病科

陈东进，Email：chendj0317@sohu.com

2015-01-21)