蜜楝不同部位绿原酸积累变化分析研究

马英丽，赵桦，杨秋琛，陈晓玲（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）



蜜楝不同部位绿原酸积累变化分析研究

马英丽，赵桦*，杨秋琛，陈晓玲
（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

摘要：利用高效液相色谱法分析测定了不同生长时期蜜楝叶、花和果实中绿原酸的含量。色谱条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3C18（4.6×150mm，5μm）柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（8∶92）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30℃。绿原酸在30.4 μg/mL～152 μg/mL范围内呈良好的线性关系，Y=27.335X-7.67（R2=0.999 8），平均加样回收率100.77 %，RSD为1.58 %（n=6）。分析结果表明，在蜜楝植物不同部位中绿原酸的含量不同，其中叶含量在4.69 mg/g～8.90 mg/g之间，花中含量在14.59 mg/g～27.30 mg/g之间，果实中含量在8.79 mg/g～16.70 mg/g之间，在同一部位绿原酸的积累随生长时间的不同而表现出一定的变化。研究结果表明，蜜楝的花及果实可作为提取制备绿原酸成分的一种资源，具有一定开发利用价值。

关键词：蜜楝；绿原酸；积累变化；含量分析

蜜楝Evodia lenticellata Huang为芸香科（Rutaceae）吴茱萸属（Evodia Forst.）植物，主要分布于我国陕西南部和四川等地[1-3]。该植物近成熟果实在民间可入药，功效同吴茱萸果实。目前，关于蜜楝果实中药用成分的研究尚不多见，本实验室曾对其果实中脂溶性成分和多糖成分及其生物学活性进行了研究报道[4-6]，本文采用HPLC法，对蜜楝不同生长阶段的叶片、花和果实中绿原酸成分进行分析研究，以期为蜜楝资源的开发利用提供参考。

绿原酸（chlorogenic acid）又名3-咖啡酰奎宁酸，是许多中草药如金银花、杜仲、茵陈等的重要有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用等多种药理活性[7-9]。此外，绿原酸还具有很好的清除自由基抗氧化作用，可抑制氧自由基对机体的损伤。绿原酸作为一种新型高效的酚型天然抗氧化剂，近年来受到人们广泛的关注，研究工作者先后对多种植物中所含绿原酸进行了分析研究[8-14]。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

绿原酸对照品：购自由上海同田生物技术股份有限公司（批号：14031321）；蜜楝果实药材：采自陕西省汉中市汉台区雷家巷；乙腈、甲醇均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为自制超纯水。

1.2仪器与设备

Agilente 1260高效液相色谱仪（包括四元泵，真空脱气机，柱温箱，二级管阵列检测器），Empower色谱工作站：美国惠普公司；UV-2550紫外分光光度计：日本岛津；AB204-S电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；IKARV 10D型旋转蒸发仪：德国IKA公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；101-2型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴有限公司；FW-177型中药粉碎机、DK98-11A型数显恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3色谱条件

Agilente 1260高效液相色谱仪；Inertsil ODS-3C18（4.6×150 mm，5 μm）柱；二级管阵列检测器。流动相：乙腈-0.4 %磷酸水溶液（8：92），流速1 mL/min，检测波长327 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

1.4检测波长的选择

利用适当浓度的绿原酸对照品溶液，以超纯水做空白，在200 nm～400 nm范围内扫描，在327 nm处有最大吸收。因此，选择327 nm作为检测波长。

1.5样品溶液的制备

取蜜楝药材，在55℃条件下烘干，粉碎过65目筛。称取约1 g，精密称定，置于具塞100 mL锥形瓶中，加40 mL 50 %的甲醇溶液，准确称重。在超声功率为240 W、超声频率为40 kHz，温度为60℃条件下，超声辅助提取30min，取出，放冷，称重，用50 %的甲醇溶液补齐重量，进样前用0.45 μm的滤膜过滤。

1.6对照品溶液的制备

精密称取绿原酸标准品15.2 mg，用50 %甲醇溶液定容至100 mL的棕色容量瓶中，得152 μg/mL绿原酸标准品溶液，以备用。

2　结果与分析

2.1线性关系考察

准确量取绿原酸标准品母液2、4、6、8 mL，分别用50 %的甲醇溶液定容至10 mL的棕色容量瓶中，配制成浓度分别为30.4、60.8、91.2、121.6 μg/mL的绿原酸标准品溶液，加上绿原酸标准品母液共5种不同浓度的溶液分别进样，每个浓度分别进样3次，每次10 μL，进样前用0.45 μm的滤膜过滤，测定峰面积，以绿原酸标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得绿原酸的回归方程为Y=27.335X-7.67（R2= 0.999 8），在30.4 μg/mL～152 μg/mL范围内呈良好的线性关系。绿原酸工作曲线图见图1，其色谱图见图2。

图1　绿原酸工作曲线图Fig.1 The standard curve for chlorogenic acid

图2　绿原酸对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of standard sample

2.2精密度试验

用绿原酸对照品溶液重复进样6次，每次进样10μL，绿原酸峰面积分别为：1 680.5、1 688.8、1 689.5、1 684.8、1 692.9、1 671.8，RSD为0.45 %。

2.3重复性试验

精密称取同一蜜楝样品5份，每份约1 g，均精密称定。按1.5项方法制备供试液，按1.3项条件测定，每份进样3次，每次进样10 μL。5份样品中绿原酸的峰面积分别为：3 415.4、3 441.13、3 382.9、3 242、3 481.2，RSD为2.68 %。说明本文方法有较好的重现性。

2.4稳定性试验

用某1份蜜楝样品制备供试液，供试液分别于提取后0、1、2、4、8、12、24 h进样。绿原酸的峰面积分别为：3 131.9、3 164.6、3 163.4、3 165、3 280.5、3 158.7、3 194.2，RSD为1.51 %。说明蜜楝样品供试液中绿原酸在24 h内稳定。

2.5加样回收率试验

精密称取同一蜜楝样品6份，各约0.2 g。向6份样品中分别加入1.2 mg绿原酸对照品，按本文方法制备供试液和测定绿原酸含量，并计算回收率。结果如表1。

表1　绿原酸加样回收率试验（n＝6）Table 1 Spiked recovery of chlorogenic acid（n＝6）

2.6样品含量测定

称取蜜楝不同时间的叶、花蕾、花和果实共18个样品，其中：叶10份（1号～10号），花蕾及花3份（11号～13号），果实5份（14号～18号），每个样品各取样3份，每份约1 g，均精密称定。按照1.5项下方法制备供试液，按照1.3项下条件测定，每份进样3次，每次进样10 μL。测得18个样品中绿原酸含量在4.458 mg/g～27.296 mg/g之间。样品含量测定色谱图见图3，其绿原酸含量和RSD见表2。

图3　蜜楝花蕾供试品色谱图Fig.3 Chromatogrem of tested sample from flower bud of Evodia lenticellata Huang注：1为绿原酸。

试验分析结果表明，蜜楝的叶片、花蕾、花以及果实在其生长阶段都含有绿原酸成分，其中早期花蕾和幼果中的含量最为丰富，分别可达27.296 mg/g和16.698 mg/g。相比之下，叶片中的绿原酸含量较低，而且在整个生长期内（4月中旬幼叶期至10月下旬落叶期）的变化较小，含量在4.690 mg/g～8.901 mg/g之间，其中在8月中下旬的含量较高，可达8.901 mg/g，生长期内叶片中绿原酸平均含量为5.67 mg/g。6月下旬至8月中上旬为蜜楝的花蕾期至盛花期，在此阶段花中的绿原酸含量较高，其中花蕾未开放时其绿原酸含量可达27.296 mg/g，盛花阶段的含量达14.594 mg/g。在8月底形成幼果时，其绿原酸含量可达16.698 mg/g，但随着果实的发育长大，其绿原酸的含量慢慢降低，到10月中上旬果实近成熟时其含量为12.782 mg/g，到10月底果实成熟变色时，其绿原酸的含量降至8.786 mg/g。由此可见，在蜜楝的不同部位，花蕾中绿原酸的含量最高，幼果中次之，这两个阶段的材料可作为提取制备绿原酸的原料。考虑到原材料产量的因素，幼果期的收率更佳，这与种植者采收果实作为药材的采收期基本吻合。

表2　蜜楝不同部位中不同生长时期绿原酸含量测定（n＝3）Table 2 Quantitative determination of chlorogenic acidat different times in different parts of Evodia lenticellata Huang（n＝3）

3　结论

HPLC法测定不同植物中绿原酸含量时所用流动相不同，多为乙腈+0.4 %磷酸混合溶液，两种溶液的比例有一定的变化。《中国药典》（2010版）在分析金银花中绿原酸含量时采用的流动相为乙腈∶0.4 %磷酸二者为13∶87[15]。本试验用乙腈+0.4 %磷酸混合溶液做为流动相，对两种溶液的配比情况与绿原酸色谱峰的变化进行了比较分析。在乙腈∶0.4 %磷酸二者为13∶87时供试液中绿原酸色谱峰的分离效果不佳，在减少乙腈、增加磷酸比例时绿原酸色谱峰分离效果渐渐好转，当将流动相比例调至8∶92时，绿原酸和其相邻组分达到了很好的分离效果。故本试验在分析蜜楝药材中绿原酸使用的流动相最终确定为乙腈∶0.4 %磷酸的比例为8∶92。这可能是由于不同材料中所含成分不同而对绿原酸成分的影响不同所致。

从不同时期蜜楝叶、花和果中绿原酸含量分析可以看出，花蕾中绿原酸含量最高（27.296 mg/g），幼果中绿原酸含量次之（16.698 mg/g），近成熟果实中的含量有所下降（13.807 mg/g），叶中含量较低。同时，各部位绿原酸的含量都随着其生长阶段的不同有一定的变化。张万明等曾对与蜜楝同属的植物吴茱萸中绿原酸的含量进行了分析测定[16]，发现不同产地吴茱萸果实中绿原酸含量在4.20 mg/g～11.65 mg/g之间。相比之下，蜜楝花蕾、花以及果实中绿原酸含量高于文献报道的吴茱萸果实中绿原酸的含量，也高于文献对艾叶（8.2 mg/g）中的绿原酸含量的报道[8]，与杜仲叶（17.8 mg/g）和胎菊（18.8 mg/g）中绿原酸的含量相当[9-10]。因此，蜜楝的花蕾、花及果实可作为提取制备绿原酸成分的一种药用资源，具有良好的开发利用价值。

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Research about the Accumulation of Chlorogenic Acid at Different Part of Evodia lenticellata Huang by HPLC

MA Ying-li，ZHAO Hua*，YANG Qiu-chen，CHEN Xiao-ling
（College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Abstract：The contents of chlorogenic acid in Evodia lenticellata Huang in different times were determined by using HPLC.The chromatographic separation was carried out using Inertsil ODS-3 C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile：0.2 % phosphoric acid（8∶92），the detection wavelength was set at 327 nm，the temperature was 30℃，and the flow rate was 1.0 mL/min.The calibration curve was linear in the range of 30.4 μg/mL -152 μg/mL and the regression equation for chlorogenic acid was Y=27.335X-7.67（R2= 0.999 8），the average recovery was 100.77 % with RSD of 1.58 %（n=6）.The result showed that there are some difference in the content of chlorogenic acid among different periods，the content of chlorogenic acid were range between 4.69 mg/g to 8.90 mg /g in the leaf，14.59 mg/g to 27.30 mg /g in the flower and 8.79 mg/g to 16.70 mg /g in the fruit.The accumulation of chlorogenic acid in the same parts of different time shows certain regularity.The study showed that the flower and fruit of E.lenticellata Huang can be used as a kind of resource to extract chlorogenic acid.

Key words：Evodia lenticellata Huang；chlorogenic acid；accumulation；contents analysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.004

基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划项目（2015KTTSSF01-02）；陕西理工学院研究生创新基金项目（SLGYCX1512）

作者简介：马英丽（1988—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：植物资源开发利用研究。

*通信作者：赵桦（1957—），男（汉），教授，硕士，研究方向：植物资源开发利用研究。

收稿日期：2015-01-22