刀豆蛋白A对CD4+CD25+调节性T细胞CCR4和CCR6表达的影响

杨永红，罗静，袁军，王树辉

(1贵州省骨科医院，贵阳550007；2贵州省人民医院)

刀豆蛋白A对CD4+CD25+调节性T细胞CCR4和CCR6表达的影响

杨永红1，罗静1，袁军2，王树辉2

(1贵州省骨科医院，贵阳550007；2贵州省人民医院)

目的 探讨刀豆蛋白A(ConA)对CD4+CD25+调节性T细胞趋化因子受体4(CCR4)和CCR6表达的影响。方法 采用密度梯度离心法分离1名健康志愿者的外周血单个核细胞，免疫磁珠阴性分选法富集CD4+T细胞。采用流式细胞术分选出CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞，并分析其纯度及存活率。采用20 μg/mL ConA对细胞进行刺激，流式细胞术检测两种细胞刺激0、24、48 h的CCR4和CCR6表达。结果 流式细胞术分选CD4+CD25+调节性T细胞的纯度为97.8%，CD4+CD25-T细胞为90.1%，两种细胞存活率均>90%。随着ConA刺激时间延长，CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞CCR4表达均呈升高趋势，CCR6表达均呈先升高后降低趋势；ConA刺激0、24、48 h，CD4+CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均高于CD4+CD25-T细胞(P均<0.01)。结论 CD4+CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均升高，经ConA刺激后CCR4表达呈时间依赖性。

调节性T细胞；趋化因子受体4；趋化因子受体6；刀豆蛋白A；T淋巴细胞

在移植免疫学领域，诱发宿主对移植物的免疫耐受一直是临床努力的方向。根据CD4+T细胞表面分子CD25表达的不同，可用流式细胞仪将其分选为功能不同的CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞。二者均可被多克隆激活剂和自身抗原激活，但前者活化后可抑制免疫反应和维持机体的耐受，后者则促进免疫炎症反应。调节性T细胞是维持外周免疫耐受的主要细胞[1, 2]，尤其是CD4+CD25+调节性T细胞，在诱发宿主对移植物的免疫耐受过程中发挥更为重要的作用[3]。趋化因子及其受体对CD4+CD25+调节性T细胞的游走与定植具有调节作用，其中比较重要的是趋化因子受体4(CCR4)和CCR6。2014年9月～2015年5月，我们采用非特异性多克隆激活剂刀豆蛋白A(ConA)激活CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞，观察对其CCR4和CCR6表达的影响。将结果现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 试剂：免疫磁珠、鸡尾酒抗体、FITC标记鼠抗人CD4抗体、APC标记鼠抗人CD25抗体、PE-Cy7标记CCR4单抗、PE标记CCR6单抗均购于美国BD公司，10% FBS购于美国HyClone公司，ConA购于深圳晶美生物工程有限公司，淋巴分离液购于天津生物化学制药有限公司。仪器：CO2细胞培养箱购于美国Thermo公司，TDL-40B水平式离心机购于北京医用离心机厂，流式细胞仪(FACS AriaTM) 购于美国BD公司，CK-31倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 外周血单个核细胞(PBMC)分离 无菌操作抽取1名健康志愿者的外周血100 mL，肝素抗凝。采用密度梯度离心法[3]分离外周血PBMC，方法如下：取肝素抗凝血与等量Hank′s液充分混匀，吸取2 mL淋巴细胞分离液，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。2 000 r/min离心20 min，离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank′s液，下层为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一白色云雾状狭窄带为PBMC层。用毛细吸管吸取后置于另一试管中，加入5倍以上体积的Hank′s液，1 500 r/min离心10 min，洗涤2次，获得外周血PBMC。

1.3 CD4+T细胞富集 采用免疫磁珠阴性分选法。用PBS将PBMC密度调整成1×107个/mL，每1×106个细胞加入鸡尾酒抗体5 μL，室温放置15 min。PBS洗涤细胞，3 000 r/min离心7 min，弃上清液。每1×106个细胞加入5 μL免疫磁珠充分混匀,室温放置30 min。用PBS将细胞密度调整为5×107个/mL，加入到12×75 mm圆底无菌试管中，每管不超过2 mL。将试管放置在磁力架上8 min，取上清液加入另一无菌试管中。磁力架上的试管加入同样体积PBS，混匀后置于磁力架上8 min，取上清液加入到第一次收集上清液的无菌试管中，再重复一次上述操作。将收集三次上清液的试管置于磁力架上8 min，吸取上清液(其中富含CD4+T细胞)。

1.4 CD4+CD25+调节性T细胞与CD4+CD25-T细胞分选及纯度检测 采用流式细胞术。每1×106个细胞加入5 μL FITC标记抗人CD4，5 μL APC标记抗人CD25,室温孵育30 min，上流式细胞仪分选CD4+CD25+调节性T细胞与CD4+CD25-T细胞，并检测其纯度。分选后的细胞经台盼蓝染色，死细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，以活细胞数占总细胞数的百分比计算存活率。存活率>90%方可进行以下实验。

1.5 CD4+CD25+调节性T细胞与CD4+CD25-T细胞CCR4和CCR6表达检测 将ConA浓度配制为20 μg/mL。CD4+CD25+调节性T细胞与CD4+CD25-细胞用RPMI1640培养基调整细胞密度为2×106个/mL。将 ConA和CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-T细胞各100 μL加入3个复孔，置于5% CO2、37 ℃孵箱中。分别于培养0、24、48 h时收集细胞,每1×106个细胞加入20 μL PE-Cy7标记的CCR4单抗及PE标记的CCR6单抗，室温孵育30 min，采用流式细胞仪检测CCR4和CCR6表达(以荧光强度表示)，严格按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 纯度及存活率鉴定 流式细胞术分选CD4+CD25+调节性T细胞的纯度为97.8%，CD4+CD25-T细胞为90.1%，两种细胞存活率均>90%。

2.2 CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞CCR4、CCR6表达比较 随着ConA刺激时间延长，CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞CCR4表达均呈升高趋势；刺激0、24、48 h CD4+CD25+调节性T细胞CCR4表达均高于CD4+CD25-T细胞(P均<0.01)。见表1。随着ConA刺激时间延长，CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞CCR6表达均呈先升高后降低趋势；刺激0、24、48 h CD4+CD25+调节性T细胞CCR6表达均高于CD4+CD25-T细胞(P均<0.01)。见表2。

表1 CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25- T细胞 CCR4表达比较

注：与CD4+CD25-T细胞比较，*P<0.01。

表2 CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25- T细胞 CCR6表达比较

注：与CD4+CD25-T细胞比较，*P<0.01。

3 讨论

调节性T细胞具有免疫低反应性和免疫调节功能，在自身免疫性疾病、肿瘤的治疗以及移植耐受诱导等方面具有广阔的应用前景[5，6]。目前认为，CD4+CD25+调节性T细胞为一种专职的调节性T细胞亚群，能够防止自身反应性T细胞的活化，并抑制其效应功能[7，8]。机体能通过调节性T细胞以“主动”方式来获得和维持自身免疫耐受。T细胞表面稳定表达CD25被认为是调节性T细胞的显著特征，细胞调节功能则集中体现在高表达CD25的CD4+T细胞上[9，10]。

CD4+CD25+调节性T细胞可被多克隆激活剂和自身抗原激活，活化后的细胞能减少自身反应性T细胞的活化，并抑制其效应功能。经T细胞抗原受体(TCR)激活后，CD4+CD25+调节性T细胞对多克隆激活剂激活的CD4+和CD8+T细胞均有明显的增殖抑制作用[11]。调节性T细胞对反应性T细胞的抑制具有抗原特异性，即调节性T细胞可因特异性抗原刺激而活化，其抑制效应只针对因同一特异性抗原刺激而活化的效应性T细胞。由于调节性T细胞对效应性T细胞的特异性和高效抑制性，其在移植免疫耐受诱导中的作用越来越受到重视。

T淋巴细胞CCR的表达取决于其活化或分化状态、组织定位等[12，13]。人外周血CD4+CD25+调节性T细胞可选择性表达CCR4，成熟的树突状细胞可通过分泌CCR4的趋化因子配体17(CCL17)及CCL22引导CD4+CD25+调节性T细胞的游走。CCR6可表达于未成熟树突状细胞、B细胞及记忆性T细胞，与同种异体反应性CD4+T细胞引起的急性移植物抗宿主反应有关[14]。CCR6只表达于抗原遭遇T细胞上，效应-记忆性调节性T细胞上可有CCR6表达，CCR6阳性表达的效应-记忆性调节性T细胞可对抗原特异反应性T细胞直接发挥免疫抑制作用[15]。本研究中流式细胞术分选调节性T细胞的纯度为97.8%，CD4+CD25-T细胞为90.1%，说明分选出的细胞纯度较高。本研究结果显示，随着ConA刺激时间延长，CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+CD25-T细胞CCR4表达均呈升高趋势，CCR6表达均呈先升高后降低趋势；ConA刺激0、24、48 h CD4+CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均明显高于CD4+CD25-T细胞。说明CD4+CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均与细胞活化状态有关，可能在调节性T细胞游走和定植局部诱导免疫耐受过程中发挥作用，而CCR4表达升高可能与其关系更为密切。本研究有助于利用CD4+CD25+调节性T细胞的活化诱导免疫耐受，可能为有效降低移植免疫排斥反应提供依据。

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贵州省优秀科技人才省长专项基金资助项目[资黔省专字(2005)144号]。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.012

R557.3

A

1002-266X(2016)32-0038-03

2015-12-21)