拔牙创不同处理方法对牙槽窝炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α浓度影响的研究

任丽珊　冯晓彤　李元帅　姬文婕　韩泽民

300162　天津市，武警后勤学院附属医院口腔科(任丽珊、李元帅、韩泽民)，心研所(冯晓彤、姬文婕)



·论著·

拔牙创不同处理方法对牙槽窝炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α浓度影响的研究

任丽珊冯晓彤李元帅姬文婕韩泽民

300162天津市，武警后勤学院附属医院口腔科(任丽珊、李元帅、韩泽民)，心研所(冯晓彤、姬文婕)

【摘要】目的比较三种不同拔牙窝处理方法对牙槽窝炎性因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响 。方法选取150例需拔除慢性炎症牙齿的患者，随机分为3组，其中B组仅搔刮拔牙窝，C组为搔刮拔牙窝+0.9%氧化钠溶液冲洗，D组为搔刮拔牙窝+1%过氧化氢溶液+0.9%氧化钠溶液冲洗。并选取同期50例无炎症拔牙患者为健康对照组(A组)，抽取牙槽窝内血液，采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA)检测炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的浓度。结果C、D组IL-1、IL-6、TNF-α分别与B组IL-1、IL-6、TNF-α浓度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C组IL-1、IL-6、TNF-α浓度与D组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论拔牙窝冲洗后牙槽窝血液炎性因子IL-I、IL-6、TNF-α的浓度与未冲洗比较明显降低，接近无炎症组，0.9%氧化钠溶液冲洗与1%过氧化氢溶液冲洗的牙槽窝炎性因子浓度无明显差异。

【关键词】牙槽窝;冲洗;白介素-1；白介素-6；肿瘤坏死因子-α

口腔种植外科目前在口腔局部及全口义齿修复领域已逐渐普及，研究表明牙列缺损后的种植修复效果明显高于常规修复[1]。因此，越来越多的患者认识到种植牙的诸多优点并逐渐接受这种修复方式。常规种植修复时机需等到拔牙创牙槽嵴吸收变化基本稳定后方可进行,而在创口愈合的早期,如果拔牙创受到各种因素的干扰,会影响甚至延缓拔牙创骨重建[2]。有文献表明，牙齿拔除后由于牙槽骨改建过程中受到内外环境的影响，常导致拔牙区牙槽骨的吸收，骨密度及骨量的不足，影响骨结合时间及效果，从而增大了口腔临床治疗中种植以及修复的难度，因此，在拔牙窝内牙槽骨重建时期，避免拔牙创及其周围牙槽骨的吸收和萎缩，在后期种植修复，恢复生理功能和美观上具有着重要的意义[3]。牙槽骨的改建、再生过程，是由破骨细胞和成骨细胞相互协调作用完成的[4]。有研究表明破骨细胞和成骨细胞的生长、分化除了受到系统因素、生长因子、机械力等作用外，炎性因子如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等也能够通过直接或间接刺激OC和OB来调节骨代谢，在牙槽骨的修复重建中也发挥了重要的作用[5]。因此降低牙槽窝炎性因子的浓度，可以促进拔牙创新骨的形成，增强拔牙窝牙槽骨密度，提高种植修复中牙槽骨与种植体的骨结合程度，在临床咬合系统的重建，生理功能的恢复上有重大的意义。本验试研究拔牙创的三种不同处理方法对牙槽窝炎性因子浓度及牙槽骨重建的影响。

1资料与方法

1.1一般资料选择2015年4～7月于我院口腔科行牙拔除术患者150例，男79例，女71例；年龄18～43岁，平均年龄(33±7)岁。拔牙原因：龋坏70例，牙周病43例，阻生齿37例。患者均通过口腔临床检查和数字化摄影检查诊断为牙周有慢性炎症且符合拔除指征。计算机随机例分为B组、C组和D组，每组50例。同时选择50例拔除无炎症牙齿的患者作为健康对照组(A组)。4组患者一般资料比较具有均衡性。

1.2材料与设备人IL-1酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)；人IL-6 ELISA试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)；人TNF-α ELISA试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)；1%过氧化氢溶液；0.9%氯化钠注射液；Eppendorf 低温高速离心机5804R；BIO-RAD酶标仪X-mark；海尔超低温保存箱。

1.3样品采集及处理于无菌环境下拔除患牙，根据不同分组处理牙槽窝后用1 ml注射器抽取牙槽窝血液0.5 ml置于1.5 ml EP管中，静置20 min后离心(23℃，1 500 r/min，10 min)，取上清液，-70℃保存。见表1。

1.4检测方法ELISA检测炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的浓度。

表1　拔牙后牙槽窝不同处理方法

1.4.1实验原理：采用双抗体夹心法来测定拔牙创血中IL-1、IL-6、TNF-α的水平。分别用纯化的IL-1、IL-6抗体、TNF-α抗体包被在3个96孔的微孔板上，制成固相抗体，向包被三种不同单抗的微孔中分别加入IL-1、IL-6、TNF-α，洗涤去掉未结合的成分后，再分别加入与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidise，HRP)标记的IL-1抗体、HRP标记的IL-6抗体、HRP标记的TNF-α抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，再次经过彻底的洗涤后加底物TMB显色。在HRP酶的催化作用下TMB转化为蓝色，最终在酸的作用下TMB的颜色由蓝转变为黄。颜色的深浅同样品中IL-1、IL-6、TNF-α的浓度呈正相关。用酶标仪在波长为450 nm的状态下测定吸光度值(OD值)，通过标准曲线计算样品中IL-1、IL-6、TNF-α的浓度。

1.4.2操作步骤

1.4.2.1提前30 min取出试剂盒，平衡至室温。从已平衡至室温的密封袋中取出抗体包被板。

1.4.2.2在酶标包被板上设标准品孔10孔，通过系列倍比稀释将100 μl标准品(IL-1标准品浓度：180 ng/L；IL-6标准品浓度：90 ng/L；TNF-α标准品浓度：450 pg/ml)做成不同浓度后，加入包被板孔中(稀释后的各孔加样量均为50 μl。IL-1的标准品浓度分别为120、80、40、20、10 ng/L；IL-6的标准品浓度分别为60、40、20、10、5 ng/L；TNF-α的标准品浓度分别为300、200、100、50、25 pg/ml)。

1.4.2.3除标准孔外，再分别设立待测样品孔和空白孔，其中空白孔不加待测样品和酶标试剂，作为空白对照孔，其他操作与待测样品孔相同。先将40 μl的样品稀释液加入到待测样品孔，然后再加10 μl的待测样品(将样品浓度稀释5倍)。

1.4.2.4用封板膜封住反应孔后，置于37℃温育箱中温育30 min。

1.4.2.5揭掉封板膜，将孔内液体弃掉，甩干，每孔加满已稀释好的洗涤液，静置30 s后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，重复洗板5次，拍干。

1.4.2.6除空白孔外，每孔加入酶标试剂50 μl，用封板膜封住反应孔后，置于37℃温育箱中温育30 min，洗板5次。

1.4.2.7向每孔中先加入50 μl的显色剂A，再加入50 μl的显色剂B，轻轻震荡混匀，避光，置于37℃孵育箱，显色15 min。

1.4.2.8每孔加入终止液50 μl，终止反应(此时孔内颜色由蓝色转为黄色)。

1.4.2.9以空白孔调零，依次测量各孔波长为450 nm的的吸光度值(OD值)。

1.4.2.10结果判定：根据标准品的OD值绘制标准曲线，以标准品浓度作纵坐标，OD值作横坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过待测样品的OD值可在标准曲线上查出其相应的浓度。

2结果

2.14组牙槽窝IL-1浓度比较B组浓度值较高，C组、D组浓度值较低，B组分别与C组、D组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。C组与D组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。C、D组与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.24组的牙槽窝IL-6浓度比较B组浓度值较高，C组、D组浓度值较低，B组分别与C、D组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。C组与D组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.34组牙槽窝TNF-α浓度比较B组浓度值较高，C组、D组浓度值较低，B组分别与C、D组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。C组与D组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组与A组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　4组患者拔牙后牙槽窝炎性因子浓度比较　±s

注：与B组比较，*P<0.01

3讨论

炎症是患牙拔除后牙槽骨改建过程中的重要影响因素，目前认为炎症一般情况下可以通过某些炎性因子来调节牙槽骨的重建与修复,常见的炎性因子有：IL-1、IL-6、TNF-α、IL-11、IL-18等[6]。炎性因子对炎性反应和触发骨发生至关重要,特别是TNF-α、IL-1、IL-6。有研究发现，TNF-α对骨代谢的影响是可以通过介导破骨细胞的增殖、分化及成熟从而抑制骨生成,延缓骨修复过程[7]。它能够直接刺激OC前体细胞，促进OC前体细胞的有丝分裂和分化,也可以间接激活成熟的OC,增强OC的骨吸收功能,加快牙槽骨的分解和吸收[8]。IL-1主要由巨噬细胞产生，可以同TNF-α共同作用，诱导破骨细胞的生成[9]。IL-1还能促进巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的产生，从而促进破骨细胞分化并增强其活力，除此之外，IL-1还被发现能够抑制破骨细胞凋亡[10]。IL-6具有调节成、破骨细胞分化的功能,并能够通过影响血管内皮生长因子的分泌来促进骨质矿化[11]。有研究显示，IL-6具有双重作用，既能促进骨生成，也能促进骨吸收,通常由内环境决定哪个作用占优势[12]。在周围组织大量存在其他炎性因子的情况下，IL-6的促骨吸收功能比较突出。因此，在牙拔除术后，牙槽骨改建过程中，多种炎性因子共同参与，相互协同，直接或间接作用于成破骨细胞，最终导致牙槽骨吸收。

骨量的丢失对今后种植修复治疗都有很大的影响，因此如何保持牙槽骨骨量在也是近年来的研究热点。在以往研究中，保持拔牙术后牙槽骨骨量的方法有很多：(1)微创拔牙法；(2)颊侧骨板增高法；(3)牙槽窝封闭技术；(4)自体骨及人工骨的植入；(5)生物膜的应用;(6)生长因子配合载体植入术；(7)组织工程技术成骨等[13-15]。以上几种方法经实验验证均可明显促进新骨形成,然而部分方法也有一定的局限性，长期效果也需进一步观察。在实际临床操作中因费用高和时间长的问题不能完全普及所有拔牙的患者。因此在治疗有效的基础上，将时间、费用和操作难度降到最低是本实验的初衷。本试验在拔牙窝处理中所使用的冲洗药物为1%过氧化氢溶液和0.9%氯化钠溶液，均为临床常用药物，相关费用低，时间短，操作难度低，患者能接受，可普及性很高。

药物冲洗在临床中常针对有重度炎症伴有脓肿或瘘道的患牙拔除术后，而常规慢性炎症患牙的拔除术后处理一般只有拔牙窝搔刮术，药物冲洗并未完全普及。本实验结果显示：慢性炎症牙齿拔除术后，牙槽窝搔刮+冲洗与单纯搔刮拔牙窝相比牙槽窝内炎性因子浓度明显降低，与A组牙槽窝内炎性因子浓度接近。拔牙后搔刮拔牙窝内肉芽组织，原理上是减少与炎症相关的细胞因子，而在此基础上行药物冲洗，进一步降低炎性因子浓度的假设通过本实验证明是可行的。本实验中1%过氧化氢溶液+0.9%氯化钠溶液冲洗后牙槽窝炎性因子浓度明显低于单纯冲洗，虽然差异无统计学意义，但考虑与样本例数少有关，这一方面有待扩大样本量进一步研究。

综上所述，慢性炎症牙齿拔除后的牙槽窝药物冲洗可明显降低炎性因子浓度，从而减少骨量的丢失，为此后种植修复打下良好的基础。此方法操作简单，耗材少，费用低，值得推广，能让广大患者接受的临床操作手段。

参考文献

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(收稿日期：2015-12-21)

【中图分类号】R 782.11

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1324-03

通讯作者：韩泽民，300162天津市，武警后勤学院附属医院口腔科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.013

E-mail：WJYYKQ2014@163.com