胃癌组织Klf4表达变化及其临床意义

于伟勇，何敬东，陈小飞，喻晓娟

(淮安市第一人民医院，江苏淮安223300)

胃癌组织Klf4表达变化及其临床意义

于伟勇，何敬东，陈小飞，喻晓娟

(淮安市第一人民医院，江苏淮安223300)

目的 探讨Krüppel样因子4(Klf4)在胃癌发生、发展过程中的作用。方法 取54例胃癌患者的癌组织及其配对癌旁正常组织标本，采用RT-PCR技术检测Klf4 mRNA的相对表达量，采用免疫组化法检测Klf4蛋白的阳性表达率；分析Klf4蛋白的阳性表达与胃癌患者临床病理参数的关系。结果 胃癌组织及癌旁正常组织Klf4 mRNA的相对表达量分别为0.12±0.04、0.25±0.06； Klf4蛋白的阳性表达率分别为46.3%(25/54)、77.8%(42/54)；两组比较P均<0.05。Klf4蛋白的阳性表达与胃癌患者肿瘤临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄无关(P均>0.05)。结论 Klf4低表达可能促进胃癌的发生、发展。

胃癌；Krüppel样因子4；临床病理参数

据统计，胃癌的发病率在各类恶性肿瘤中居首位[1]。研究发现，胃癌的发生、发展及生物学行为受多个分子信号通路的影响，其中转录因子是调控这些分子信号通路的重要因素[2]。Krüppel样因子4(Klf4)是一种含有锌指结构的转录因子，又称胃肠富集KLF，在人体多种组织中广泛存在；可参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞的生物学行为，在不同组织中可与不同的靶基因相互作用，发挥抑癌或促癌作用[3,4]。本研究探讨Klf4在胃癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2008年3月～2011年1月在我院行手术治疗的54例胃癌患者[男34例、女20例，年龄25～85(53.2±10.4)岁，其中年龄<60岁24例、≥60岁30例]癌组织及其配对癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)标本，均经组织病理检查明确诊断。组织分化程度：高分化13例，中分化20例，低分化21例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例；有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者23例。

1.2 胃癌组织及癌旁正常组织Klf4表达检测 Klf4 mRNA检测：采用RT-PCR法。取胃癌组织及其癌旁正常组织，采用RNA微量提取试剂盒提取总RNA。总RNA经DNAse Ⅰ处理，使用M-MLV逆转录试剂盒逆转录合成cDNA；采用ABI prismTM7700型荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应。Klf4引物设计：上游引物5′-GCCACGTCTCCACACATCAG-3′，下游引物5′-TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT-3′。PCR反应体系为20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火20 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算Klf4 mRNA的相对表达量，以GAPDH基因作为内参。Klf4蛋白检测： 采用免疫组化S-ABC法[5]。取胃癌组织及其癌旁正常组织，4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液抗原修复，3%过氧化氢阻断，加入Klf4兔抗人多克隆抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，加入二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片，倒置显微镜下观察结果。以细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。阳性结果根据染色强度及阳性细胞比例综合判定。染色强度：无色记0分，淡黄色记1分，黄色记2分，棕褐色记3分；阳性细胞比例：<10%记0分，≥10%～<25%记1分，≥25%～<50%记2分，≥50%～<75%记3分，≥75%记4分。两项之和≤1分为阴性，≥2分为阳性。分析Klf4蛋白的阳性表达与胃癌患者临床病理参数的关系。

2 结果

胃癌组织及其癌旁正常组织Klf4 mRNA的相对表达量分别为0.12±0.04、0.25±0.06； Klf4蛋白的阳性表达率分别为46.3%(25/54)、77.8%(42/54)；两组比较P均<0.05。Klf4蛋白的阳性表达与胃癌患者临床病理参数的关系见表1。

3 讨论

Klf4属于Klf蛋白家族成员之一，主要在消化道黏膜及上皮细胞中表达[6,7]。研究发现，Klf4可参与细胞增殖、分化及胚胎发育等生命过程的调控。因细胞过度增殖和异常分化是肿瘤的主要生物学特征，故推测Klf4可能与肿瘤的发生、发展密切相关。孙雪萍等[8]研究发现，Klf4在肿瘤中的作用是双重的，既可作为抑癌基因又可作为致癌基因。在结肠癌的发生、发展过程中，Klf4是一个潜在的抑制基因，人结肠癌细胞中Klf4转录水平的甲基化修饰或某些位点的缺失，可导致癌细胞的侵袭性增强[9]；在子宫内膜癌组织中Klf4表达上调，其作为致癌基因发挥促进肿瘤发生的作用[10,11]。

表1 Klf4蛋白的阳性表达与胃癌患者临床病理参数的关系

胃癌的发生、发展是多种癌基因、抑癌基因共同作用的结果，但其发生机制尚不明确。Hu等[12]研究发现，胃溃疡组织与正常胃组织Klf4表达比较无统计学差异，而胃癌组织中Klf4表达明显低于癌旁正常组织。Fang等[13]研究发现，Klf4基因在胃癌组织中的表达低于正常胃组织，且Klf4基因的表达水平与肿瘤组织分级相关，发生淋巴结转移的胃癌组织中其表达低于未发生淋巴结转移的胃癌组织。胃癌组织中Klf4表达下调可引起APC表达缺失或下调，通过Wnt/APC/β-catenin信号通路介导胃癌的发生、发展[13]。

本研究结果显示，胃癌组织Klf4 mRNA的相对表达量及Klf4蛋白的阳性表达率均明显低于癌旁正常组织，与以往文献[14，15]报道基本一致。提示Klf4低表达可能参与了胃癌的发生。本研究还发现，胃癌组织Klf4蛋白的阳性表达与肿瘤的临床分期、组织分化程度及淋巴结转移有关，提示Klf4表达缺失可能导致胃黏膜屏障破坏，促进癌细胞转移，其低表达可能提示胃癌患者预后不良。有报道称，Klf4是控制胃癌细胞周期G1期向S期进展的关键介导因子；当Klf4表达缺失或下调时，细胞增殖失去控制，进而促进胃癌的发生、发展[6,7]。但关于Klf4低表达促进胃癌发生、发展的确切机制尚需进一步研究。

综上所述，胃癌组织中Klf4表达降低，其低表达可能与胃癌的发生、发展有关。

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