头花蓼对幽门螺杆菌生长及代谢相关基因的影响*＊?

任艳君，莫　非，张　姝，何　芸，吴　琼，谢小琴，赵书琴

(贵州医科大学临床检验教研室，贵州贵阳　550004)



头花蓼对幽门螺杆菌生长及代谢相关基因的影响*＊?

任艳君，莫非＊＊，张姝，何芸，吴琼，谢小琴，赵书琴

(贵州医科大学临床检验教研室，贵州贵阳550004)

［摘要］目的:观察苗药头花蓼对幽门螺杆菌(H.pylori)生长代谢及其相关基因的表达的影响。方法:将H.pylori菌接种于不同浓度的头花蓼培养基(头花蓼终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L)，测定无H.pylori菌生长时头花蓼的最小抑菌浓度(MIC) ;将H.pylori菌接种于无头花蓼培养基(对照组)和头花蓼MIC培养基(头花蓼组)培养36 h，每隔4 h采用用酶标仪检测590 nm处的吸光度值，绘制H.pylori生长曲线;用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测2组H.pylori菌液生长代谢相关基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的表达水平。结果:头花蓼对H.pylori最低抑菌浓度MIC为4 g/L，头花蓼组H.pylori生长曲线位于对照组之下，Real－time PCR结果显示头花蓼作用后，头花蓼组生长代谢相关基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr基因mRNA均呈减弱趋势，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:头花蓼在体外对H.pylori具有明显抑制作用，可通过影响细菌生长代谢相关基因的表达来抑制H.pylori的生长。

［关键词］螺杆菌，幽门;生长;头花蓼;代谢;基因

＊＊通信作者E-mail: 354406804@ qq.com

网络出版时间: 2016－02－23网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2009.032.html

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori.H.pylori)是革兰阴性的微需氧细菌，能定植在人胃黏膜表面，可诱发多种胃部疾病［1］。95 %～100 %的十二指肠溃疡患者及80 %的慢性胃炎患者与H.pylori感染有密切的关系，其感染程度与症状严重程度成正相关［2］。在抗H.pylori治疗中，由于抗生素的滥用，耐药问题日益突出［3］，寻找新的治疗药物尤为重要。苗药头花蓼为贵州特有，研究表明头花蓼对多种细菌具有良好的抗菌效果［4］。本课题以头花蓼为研究对象，观察其对H.pylori生长代谢相关基因延胡索酸还原酶铁硫亚基(FrdB)、延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基(FrdA)、非血红素铁蛋白(Pfr)及乙酰脲利用蛋白A(HyuA)表达水平的影响，观察苗药头花蓼是否可影响H.pylori的生长周期，探讨头花蓼对H.pylori的抑菌机制。

1　材料与方法

1.1主要材料

H.pylori(ATCC700392)国际标准测序株购自美国菌种保藏中心，哥伦比亚琼脂粉(CM0331B)和脑心浸液粉(CM0225)购自OXOID，无菌脱纤维羊血购于广州蕊特生物科技有限公司。苗药头花蓼浸膏(13143)由原国家药检局新药审评中心研究员王子厚教授提供。

1.2培养基的制备

1.2.1配制哥伦比亚血琼脂称取称取哥伦比亚血琼脂粉3.8 g，加入蒸馏水89 mL，121℃高压灭菌15 min，待琼脂冷却至50～55℃时加入无菌脱纤维羊血10 mL、混合抗生素溶液(万古霉素30 mg、多黏菌素B 20 mg、两性霉素20 mg及TMP 25 mg，混合溶解于无菌双蒸水100 mL。) 1 mL，充分混匀，倾倒于直径为90 mm的无菌平皿中，使琼脂厚度为3～4 mm，随机取一板置于37℃恒温箱内培养24 h做无菌试验，其余放入4℃冰箱备用。

1.2.2配制液体培养基称取脑心浸液粉3.8 g，用无菌双蒸水90 mL将其溶解，121℃高压灭菌15 min，冷却后加入胎牛血清10 mL，分装于无菌离心管中，置于4℃备用。

1.2.3配制含药培养基称取头花蓼64 g于无菌蒸馏水100 mL中，配成浓度为640 g/L的头花蓼溶液。于哥伦比亚血琼脂中加入递减体积的头花蓼溶液，轻摇混匀，制备成不同浓度的含药培养基，使其终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L。

1.3测定头花蓼最小抑菌浓度

采用三气培养箱，微需氧环境(37℃、5% CO2、10% O2、85% N2)培养H.pylori 48～72 h，阳性且无其它菌污染者进行传代增菌，并通过观察其菌落形态，尿素酶、触酶、氧化酶试验以及革兰染色进行菌株鉴定［5］;参照NCCLS标准，采用二倍琼脂稀释法［6］，刮取培养48～72 h的H.pylori接种于液体培养基中，将其稀释至1×1011cfu/L，用无菌棉签蘸取菌液均匀接种于不同终浓度的含药培养基上，于37℃三气培养箱中微需氧环境中培养72 h后观察结果，以无H.pylori菌生长的最小的头花蓼药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

1.4绘制H.pylori生长曲线

取生长于哥伦比亚血琼脂上的H.pylori菌接种于液体培养基，用液体培养基稀释至含菌量为1011～1012cfu/ L的菌悬液。参照文献［7］方法，取10个无菌24孔板，每个板设置头花蓼组及对照组，头花蓼组依次加入液体培养基、5% H.pylori菌悬液、相应体积的头花蓼溶液至其终浓度为MIC，对照组加入等体积的5% H.pylori菌悬液，用液体培养基定容至300 μL，每个组设置3个重复孔。瞬时离心混匀后置于37℃微需氧培养箱培养36 h。以液体培养基调零，每隔4 h取出一个24孔板用酶标仪测其各个孔在590 nm处的吸光度值。根据3次重复实验数据求得OD590平均值，绘制H.pylori的生长曲线。

1.5检测生长代谢相关基因mRNA

采用Trizol法分别提取头花蓼组及对照组H.pylori的mRNA，用酶标仪对提取的mRNA进行测定，计算OD260/OD280比值和mRNA浓度。将mRNA反转录为cDNA，将gryB设为内参基因，FrdA、FrdB、HyuA、Pfr为目的基因。探针和序列由NCBI检索，根据GenBank上已发表的序列，采用primer 5设计引物(表1)。反应条件为95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，重复40个循环，每组做3个生物重复。采用2－ΔΔCT法，对目标基因的表达差异进行分析。

1.6统计学方法

应用SPSS 17.5软件对相关数据进行统计学分析，组间比较用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　PCR的引物信息Tab.1 Primer information of PCR

2　结果

2.1 H.pylori生长曲线

头花蓼组H.pylori生长曲线有明显变化，细菌在对数期不能进入正常的生长高峰。头花蓼组的生长曲线位于对照组之下，表明头花蓼对H.pylori的生长有抑制作用，且主要抑制其对数生长期的细菌分裂。见图1。

图1　头花蓼对H.pylori生长的影响Fig.1 Effect of Polygonum capitatum on the growth curve of H.pylori

2.2 mRNA的提取

提取的H.pylori RNA电泳图谱显示16sRNA，23sRNA条带较清晰，亮度为1∶2，且OD260/OD280的比率均在1.8～2.0，表明提取的mRNA完整且无DNA与蛋白污染。

2.3 H.pylori生长代谢相关基因检测

荧光定量PCR仪检测头花蓼组及对照组中H.pylori生长代谢相关基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr及内参基因gryB的荧光信号Ct值，通过融解曲线分析，结果显示FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的溶点温度分别为81.5℃、82.5℃、80.0℃及80.5℃，融解曲线均为单峰，表明PCR扩增为特异性扩增，头花蓼组H.pylori生长代谢相关基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr的mRNA表达均低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2　头花蓼组和对照组H.pylori生长代谢相关基因FrdB、FrdA、HyuA及Pfr表达Fig.2 The expression of FrdB，FrdA，HyuA and Pfr gene in the control group and experiment group

3　讨论

目前H.pylori对抗生素的耐药性日趋严重，探索新的理想的抗H.pylori药物具有重要的现实意义。头花蓼是一种传统苗药，含有没食子酸、原儿茶酸乙酯、没食子酸乙酯等11个化合物［8］，本课题组前期研究发现，头花蓼具有抗炎抗菌的效果，但其相关机制尚不清楚。本试验证明，头花蓼对H.pylori标准株的MIC为4 mg/L，通过与其它抗H.pylori中药进行比较，H.pylori对头花蓼的敏感性明显高于其它中药(黄芩苷25～200 mg/mL;黄连素12.5 mg/mL)［9］，表明头花蓼在抗H.pylori方面具有应用研究价值。生长曲线可反映微生物的群体生长规律［10］，通过生长曲线的变化可揭示药物的抑菌效果，本研究发现，加入头花蓼后H.pylori生长曲线发生了变化，说明头花蓼中可能某些成份不利于H.pylori生长。

延胡索酸还原酶(FRD)是可将延胡索酸盐转为琥珀盐酸的一种酶，是重要的微生物代谢为无氧呼吸的一部分，为H.pylori的无氧呼吸提供能量ATP，革兰阴性菌及多数兼性厌氧革兰阳性菌，都具有这种特性。这种酶含有四个亚基: FrdA、FrdB 、FrdC、FrdD，其中亲水性的FrdA和FrdB亚基形成酶催化域，参与能量代谢。本实验中，药物作用后的FrdA、FrdB基因表达均下调，该结果与国外学者Haraguchi等［11］研究一致，再次验证头花蓼通过影响H.pylori的呼吸链而阻止细菌的能量代谢，抑制细菌的生长。此外，非血红素铁蛋白(Pfr)［12］、乙酰脲利用蛋白A(HyuA)在细菌的能量代谢中也有重要作用。Pfr是一类不含血红素但含铁的蛋白，保证H.pylori在缺乏铁离子的恶劣环境中，维持H.pylori的氧化还原代谢和能量代谢。本研究结果显示，头花蓼作用H.pylori后，Pfr基因表达量下调，提示头花蓼可通过影响H.pylori对铁的利用，干扰H.pylori的氧化还原代谢和能量代谢功能，从而抑制了H.pylori的生长; HyuA可水解焦谷氨酸，而亮氨酰胺肽酶(LAP)则由于变构作用，具有广泛的底物特异性，可水解多种氨基酸。这两种蛋白酶可确保足够的氨基酸从多肽中释放。有文献显示，抑氨肽酶素b可通过抑制LAP的活性抑制H.pylori的生长［13］。本研究显示，H.pylori经头花蓼作用后，HyuA基因表达量下调，提示了头花蓼通过影响H.pylori氨基酸的代谢，影响了其生长代谢过程。

4　参考文献

［1］蒋玲，李雪，刘恩思，等.幽门螺杆菌的研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2015(17) : 3015－3017.

［2］程绍海.幽门螺旋杆菌相关性慢性胃炎探讨［J］.中国医药指南，2012(8) : 184－185.

［3］王志坤，刘启泉，靳凌瑜，等.薏苡利浊清毒方合并奥美拉唑治疗幽门螺旋杆菌相关性十二指肠溃疡的临床研究［J］，2011(8) : 1593－1595.

［4］张丽娟，王永林，王珍，等.头花蓼活性组分化学成分研究［J］.中药材，2012(9) : 1425－1428.

［5］李岩，葛林梅，杨佩满，等.幽门螺杆菌的分离与鉴定［J］按摩与康复医学，2012(1) : 4－5.

［6］曾祥吉，李东霞.中药抑菌实验方法的研究［J］.现代中西医结合杂志，2011(2) : 518－520.

［7］Xia HX，English L，Keane CT，et al.Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media［J］.Clin Pathol，1993(46) : 750－753.

［8］荆文光，赵叶，张开霞，等.头花蓼水提取物化学成分研究［J］.时珍国医国药，2015(1) : 47－50.

［9］吴明慧，黄衍强，黄赞松，等.黄连素、大黄素、五味子及黄芩苷对幽门螺杆菌多重耐药株的体外抑菌作用［J］.世界华人消化杂志，2013(30) : 3247－3251.

［10］刘世旺，徐艳霞，石宏武.酢浆草乙醇提取物对细菌生长曲线的影响［J］.北方园艺，2007(3) : 113－115.

［11］Haraguchi H，Tanimoto K，Tamura Y，et al.Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflate［J］.Phytochemistry，1998(1) : 125－129.

［12］Waidner B，Greiner S，Odenbreit S，et al.Essential role of ferritin Pfr in Helicobacter pylori iron metabolism and gastric colonization［J］.Infection and immunity，2002 (7) : 3923－3929.

［13］Dong L，Cheng N，Ming WW，et al.The leucyl aminopeptidase from Helicobacter pylori is an allosteric enzyme［J］.Microbiology，2005(151) : 2017－2023.

(2015－08－22收稿，2015－12－31修回)

中文编辑:戚璐;英文编辑:赵毅

Effect of Polygomun capitutam on Helicobacter Pylori Growth Metabolism Associated Gene

REN Yanjun，MO Fei，ZHANG Shu，HE Yun，WU qiong，XIE Xiaoqin，ZHAO Shuqin
(Department of Laboratory Science，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To observe the effect of Polygonum capitatum on growth metabolism associated genes expression of H.pylori.Methods: H.pylori fungus was inoculated in varied Polygonum capitatum concentration medium (final concentration as 64，32，16，8，4，2，1 and 0.5 g/L) ; testing minimal inhibitory concentration (MIC) of Polygonum capitatum when no H.pylori grows; H.pylori fungus was inoculated in no-Polygonum capitatum (control group) and Polygonum capitatum MIC (Polygonum capitatum group) to cultivate for 36 h，and test Absorbance value of 590 nm in every 4 h by ELIASA; then draw the H.pylori growth curve; real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to test expression level of growth metabolism associated genes FrdA，FrdB，HyuA and Pfr both groups H.pylori fungus solution.Results: the min MIC concentration of Polygomun capitutam on H.pylori was 4 g/L，growth curve of Polygomun capitutam H.pylori was below control group; Real-time PCR results showed that after Polygomun capitutam taking effect，growth metabolism associated genes of Polygomun capitutam group，mRNA of FrdA，FrdB，HyuA and Pfr gene were decreasing，differences had statistical significance (P＜0.05).Conclusion: Polygonum capitatum has obvious inhibitory effect on H.pylori in vitro，Polygonum capitatum can inhibit the growth of H.pylori by affecting the growth of growth metabolism related genes.

［Key words］Helicobacter pylori; growth; Polygonum capitatum; metabolism; gene

*［基金项目］贵州省科学技术基金［黔科合J字(2014) 2027号］;贵州省科技合作计划［黔科合LH字(2015) 7417号］;贵州省卫生计生委科学技术基金(gzwjkj2015－1－1003) ;贵阳市科技局计划项目［筑科合同(20141001)］

［中图分类号］R961.1

［文献标识码］A

［文章编号］1000-2707(2016) 02-0175-04