两种植物精油对白纹伊蚊的熏杀及酯酶活性的影响*＊?

周长荣，温小军，刘　磊

(贵州医科大学基础医学院生物学教研室，贵州贵阳　550025)



两种植物精油对白纹伊蚊的熏杀及酯酶活性的影响*＊?

周长荣，温小军＊＊，刘磊

(贵州医科大学基础医学院生物学教研室，贵州贵阳550025)

［摘要］目的:测定珊瑚姜精油和樟树叶精油对白纹伊蚊雌性成蚊的熏杀活性及熏杀蚊虫的作用机理。方法:用水蒸汽蒸馏法提取珊瑚姜块茎精油和樟树鲜叶精油，三角瓶法测定两种精油对白纹伊蚊雌性成蚊的熏杀活性，微板法检测两种精油对白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶(AChE)和非特异性酯酶(NSE)活性的影响。结果:珊瑚姜精油和樟树叶精油对白纹伊蚊24 h熏蒸LC(50)分别是80.208 μg/cm3、20.709 μg/cm3;在78.696 μg/cm3和31.976 μg/cm3剂量下，珊瑚姜精油和樟树叶精油对白纹伊蚊的KT(50)分别为35.759 min和6.341 min;两种植物精油对白纹伊蚊AChE均有抑制作用，酶活性抑制率分别为29.97%和4.03%;两种精油对白纹伊蚊的NSE有促进作用，酶活性增长率分别为21.55%和18.62%。结论:樟树叶精油更适宜作为植物源灭蚊产品的基础材料。

［关键词］伊蚊属;植物精油类;熏杀活性;乙酰胆碱酯酶;非特异性酯酶

＊＊通信作者E-mail: 2547285543@ qq.com

网络出版时间: 2016－02－23网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1959.024.html

白纹伊蚊(Aedes albopictus)是我国南方最常见的吸血蚊虫，是登革热、乙型脑炎等疾病的传播媒介，属于ISSG (invasive species specialist group)列出的全球100种恶性扩散的物种之一［1］。白纹伊蚊也是我国评定农药杀虫剂的指定试虫(GB/T 17322.10—1998)［2］，一直是我国公共卫生防治的主要对象。防治蚊虫时通常使用化学杀虫剂，但长期使用会导致严重的“3R”问题［3］。与传统的化学杀虫剂相比，植物精油具有对人类安全、环保和蚊虫不易产生抗性等优点，并且大量的研究证明植物精油对害虫有熏杀活性，可作为蚊虫防制的有效措施之一［4－7］。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是生物神经传导中的一种关键酶，其活性的变化是杀虫剂毒理与抗性研究的重要指标［8］。非特异性酯酶(non-specific esterase，NSE)普遍存在于昆虫体内各种组织中，能够催化水解神经毒，NSE的含量和活性变化也是杀虫剂抗性及毒理研究的重要依据［9－10］。本研究通过检测珊瑚姜和樟树两种植物精油对白纹伊蚊成蚊的熏杀活性，并测试其对白纹伊蚊体内AChE和NSE活性的影响，为筛选和研制环保、高效的植物源灭蚊产品提供科学依据。

1　材料与方法

1.1供试精油

珊瑚姜(Zingiber corallinum Hance)干燥块茎购自贵钢花鸟市场，樟树［Cinnamomum camphora (L.)］鲜叶采自贵州医科大学校园，经贵州医科大学药学院龙庆德教授鉴定。块茎过40目筛，鲜叶剪成1 cm×2 cm碎片。精油通过水蒸汽蒸馏法提取:将150 g的植物材料置于2 000 mL的圆底烧瓶中，加入1 500 mL的蒸馏水，过夜浸泡;加热蒸馏6 h。珊瑚姜精油和樟树叶精油的提取率(油/鲜重)和密度分别为5.2%和0.905 g/mL、1.1%和0.919 g/ mL。精油收集于棕色试剂瓶内，经无水硫酸钠干燥后，保存于4℃冰箱中备用。

1.2供试蚊虫

实验用虫为贵州医科大学生物学教研室蚊房训养的白纹伊蚊Aedes albopictus雌性成蚊。驯养温度(26±2)℃，湿度(65±5) %，光照周期14 L∶10 D。

1.3主要试剂和主要仪器

主要试剂有5，5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)，碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)，异丙醇，乙酸-2-萘酯(β-NA)，坚固蓝B盐。主要仪器有Bioteck Epoch型酶标仪，TGL16M型台式高速冷冻离心机。

1.4熏杀活性测定

按照参考文献［10］三角瓶熏蒸法改进后，在温度(26±2)℃、湿度(65±5) %条件下进行两种植物精油对白纹伊蚊的熏杀活性测定:用吸蚊管吸取30头羽化后2～3 d未吸血的的成蚊放入250 mL三角瓶内(实测容积为345 mL)并以白纱布封口。在白纱布上开1.5 cm宽的小口，在滤纸条(10 cm×1 cm)下端1～2 cm处分别滴加5组不同剂量的精油，使之成等差分布。珊瑚姜精油和樟树叶精油熏蒸白纹伊蚊的剂量分别是26.232、52.464、78.696、104.928及131.160 μg/cm3和10.659、21.317、31.976、42.634及53.293 μg/ cm3。待精油渗透滤纸后将滤纸条从纱布开口处深入三角瓶内，一端固定于三角瓶口，迅速用保鲜膜封口并开始计时，每2 min记录一次被击倒的试虫数，待蚊虫全部被击倒后，将全部试虫移入洁净的1 000 mL烧杯中，用白纱布封口，用10%的葡萄糖水饲养24 h后，观察并记录试虫死亡数。每个处理组重复3次，同时设空白对照组，死亡率取3次重复的平均值。

1.5酶源制备

参照参考文献［11］取羽化后1～5 d尚未吸血的雌蚊30只，精油的熏杀LC95剂量(珊瑚姜和樟树叶的LC95值分别是130.496和51.739 μg/cm3)，用1.4项下方法处理成蚊，实验设3个处理组和1个对照组;待蚊虫翻倒后取出，用流动蒸馏水冲洗并用滤纸吸干水分;将处理后的单只蚊虫放入1.5 mL的离心管中并加入100 μL预冷的磷酸缓冲液(AChE pH7.2，NSE pH 6.8)，冰浴研磨混匀，4℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液加入900 μL预冷的磷酸缓冲液稀释，备用。

1.6 AChE活性测定

参照张云等［12］的方法并加以改进，将100 μL蚊虫匀浆液加入到96孔酶标板中，每孔加入ATChI液100 μL (ATChI 75 mg溶于pH 7.2的磷酸缓冲液100 mL)，30℃条件下水浴30 min，每孔加入DTNB液100 μL(DTNB 13 mg溶于pH 7.2的磷酸缓冲液100 mL)以终止反应，5 min后，在酶标仪410 nm波长下读取OD值，计算酶活性增长率公式:酶活性增长率(%) = (处理组OD值－对照组OD值) /对照组OD值×100%。

1.7 NSE活性的测定

按张云等［12］文献的方法进行调整:先将100 μL蚊虫匀浆液加入96孔酶标板中，每孔加入β-NA溶液100 mL(β-NA 56 mg依次溶于pH 6.8磷酸缓冲液10 mL和90 mL)，25℃条件下水浴10 min，每孔再加坚固蓝B盐溶液100 μL(坚固蓝B盐100 mg溶于100 mL蒸馏水)，反应5 min后置于酶标仪上490 nm波长下读取OD值。按照1.6项下公式计算NSE活性。

1.8统计学处理

用SPSS 17.0统计软件通过概率值分析法分别计算出两种植物精油熏杀蚊虫的KT50值、LC50值、LC95值、95%置信区间和毒力回归方程。AChE 和NSE的活性以OD值表示，两种精油处理比较用t检验，两种植物精油对白纹伊蚊AChE和非特异性酯酶活性的影响以酶活性增长率表示，酶活性增长率为为负值表示精油对该酶具有抑制作用，为正值表示精油对该酶具有促进作用。

2　结果

2.1两种植物精油对白纹伊蚊的熏杀活性

用珊瑚姜和樟树叶精油处理白纹伊蚊成蚊后，发现成蚊飞行速度加快，之后开始沿着三角瓶壁挣扎，行动缓慢，翻倒又爬起数次后最终被击倒，提示珊瑚姜精油和樟树叶精油对白纹伊蚊有熏杀活性，对白纹伊蚊的24 h熏蒸LC50依次为80.208、24.709 μg/ cm3，即24 h樟树叶精油对蚊虫的LC50值小于珊瑚姜精油。随着精油浓度的增加，白纹伊蚊被击倒速度明显加快，24 h死亡率也逐渐增加，对蚊虫的熏杀效果增强，樟树叶对白纹伊蚊的KT50(6.341 min)所需要的时间比珊瑚姜(35.759 min)的少。空白对照组蚊虫无死亡。见表1、2。

表1　两种植物精油对白纹伊蚊成蚊24 h毒杀活性Tab.1　Insecticidal activity of two essential oils against adult of Aedes albopictus at 24 hours

表2　不同浓度两种植物精油对白纹伊蚊24 h熏蒸效果Tab.2　Fumigation effect of two essential oils against adult of Aedes albopictus at different concentrations in 24 hours

2.2两种植物精油对白纹伊蚊的酯酶活性的影响

分别以2种植物精油的LC95剂量熏蒸白纹伊蚊后，蚊体内的AChE表现为抑制作用，酶活性抑制率分别为29.97%和4.03%;两种精油对白纹伊蚊的NSE均表现出明显的诱导作用，酶活性增长率分别为21.55%和18.62%;珊瑚姜精油对白纹伊蚊的AChE的抑制作用和NSE的诱导作用比樟树叶精油强。

3　讨论

本研究中，熏杀实验开始前，蚊虫基本上停在三角瓶底部，加入植物精油后蚊虫表现十分活跃，并且持续不规则旋转飞动，反复飞起和滑落，最终仰面倒在瓶底，肢体抽搐。这种现象和杨频等［13］报道的蚊虫神经系统中毒熏杀现象相似，说明白纹伊蚊经两种精油处理后，表现为神经系统中毒。两种植物精油对白纹伊蚊成蚊都具有熏杀作用，其中樟树叶对白纹伊蚊的熏杀活性更强(LC50值为24.709 μg/mL)，其效果优于岭南花椒(LC5047.14 μg/ mL)［14］、竹叶花椒(LC5029.52 μg/mL)［15］、辽细辛(LC5069.35 μg/mL)［16］等植物的精油。

本研究中，经两种植物精油处理后，白纹伊蚊体内的AChE与NSE活性都表现出明显变化，这与杨频［17］等的报道相符，表明两种植物精油的作用靶标是AChE和NSE。乙酰胆碱(ACh)在中枢神经系统内由中枢胆碱能神经末梢释放，是中枢神经重要的递质之一。AChE是ACh的水解酶，能将ACh水解为胆碱和乙酸，终止神经冲动。伍一军等［18］的报道表明，当AChE活性被抑制时，Ach不能被及时分解，从而在突触间隙内堆积，导致信号传递被阻断，昆虫出现运动障碍、呼吸麻痹等中毒症状，最终死亡。白纹伊蚊分别经两种精油处理后，体内的AChE活性被抑制，Ach不能被及时分解导致信号传递被阻断，故蚊虫表现出不规则的旋转运动。NSE是蚊虫体内主要的解毒酶，能够催化水解神经毒素，其活性升高，则说明蚊虫的解毒作用和对神经毒素的耐受性增强。Silvia等［19］指出，杀虫剂可抑制昆虫体内的NSE活性，这样会导致昆虫的解毒能力及对药物的耐受性下降。蚊虫体内的解毒酶NSE对珊瑚姜精油和樟树叶精油的活性有一定影响。白纹伊蚊经过两种植物精油处理后NSE活性增强，说明白纹伊蚊对两种精油的解毒作用很强，能够迅速降解进入体内的精油活性成分，但是经珊瑚姜精油处理过的白纹伊蚊NSE比经樟树叶处理过的强，说明珊瑚姜精油的解毒酶活性比较强，能够迅速降解进入体内的精油活性成分，所以需要更高浓度的精油才能发挥杀虫作用，这与熏杀结果中熏杀白纹伊蚊所需要的珊瑚姜浓度比樟树叶高相吻合。白纹伊蚊经两种精油处理后体内AChE和NSE活性的影响程度不同的原因可能是两种精油中化合物的种类及含量和LC95剂量不同。植物精油组分与蚊虫体内AChE和NSE活性变化仍需进一步研究。

综上所述，通过两种植物精油对白纹伊蚊的熏杀活性、24 h死亡率及对蚊体内AChE和NSE活性的影响的比较，樟树叶对白纹伊蚊的LC95值较低，熏杀活性较强，，并且对蚊虫体内AChE的诱导作用较弱，NSE的抑制作用较强。因此樟树叶精油更适宜作为植物源灭蚊产品的基础材料。

图1　两种植物精油的LC95剂量对白纹伊蚊AChE和NSE活性的影响Fig.1　Effects of the two essential oils on activity of AChE and NSE of Aedes albopictus at LC95concentration

4　参考文献

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(2015－12－15收稿，2016－01－20修回)

中文编辑:吴昌学;英文编辑:赵毅

Effect of Two Plant Essential Oils on Fumigating Insecticidal Activities of Aedes Albopictus and Esterase Activity

ZHOU Changrong，WEN Xiaojun，LIU Lei
(Department of Biology，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To investigate the fumigating insecticidal activities of essential oils extracted from Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) against the female adult mosquitoes of Aedes albopictus and the fumigant mechanism.Methods: Essential oils were extracted from roots of Zingber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora by steam distillation.The fumigating activities of these essential oils against Aedes albopictus were measured by erlenmeyer flask method.The activation changes of acetylcholinesterase (AchE) and non-specific esterase (NSE) of the female adults mosquitoes of Aedes albopictus fumigant treated with two essential oils were measured by the microplate assay.Results: The LC(50)values of Zingber corallinum Hance and Cinnamomum camphora against Aedes albopictus at 24 h were 80.208 μg/cm3、20.709 μg/cm3respectively.The KT50 values of Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) against the female adults mosquitoes of Aedes albopictus at fumigating concentration 78.696 and 31.976 μg/cm3were 35.759 and 6.341 min respectively.The acetylcholinesterase of Aedes albopictus which was treated by Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) was inhibited.The reduced rates were 29.97% and 4.03%.The esterase activity increased rates were 21.55% and 18.62%.Conclusion: The results indicate that extracted oil from Cinnamomum camphora (L.) is effective potential mosquitocide.

［Key words］Aedes albopictus; plant essential oils; fumigating insecticidal activity; acetylcholinesterase; non-speci esterase

*［基金项目］贵州省科技厅与贵州医科大学联合基金［黔科合LG字(2012) 15号］

［中图分类号］Q949.32

［文献标识码］A

［文章编号］1000-2707(2016) 02-0162-04