自发性脑出血中红细胞对血脑屏障通透性的影响

江雷振 史保中 葛朋莉

1)河南科技大学第一附属医院神经外科 洛阳 471000 2)河南安阳地区医院血液科 安阳 455000

自发性脑出血中红细胞对血脑屏障通透性的影响

江雷振1)史保中1)葛朋莉2)

1)河南科技大学第一附属医院神经外科 洛阳 471000 2)河南安阳地区医院血液科 安阳 455000

目的 研究自发性脑出血(SICH)中红细胞对血脑屏障(BBB)通透性的影响。方法 大鼠自体血脑内注射法造成自发性脑出血模型，用脑立体定位仪向大鼠右侧尾状核注入自体全血(WB)或红细胞(RBC)以建立SICH动物模型。分组按照不同时间点(6 h、1 d、3 d、5 d)处死大鼠，处死前经尾静脉注射2%伊文思蓝(Evans blue，EB)溶液 2 mL/kg，取标本后用甲酰胺浸泡法检测脑组织EB含量。结果 BBB通透性检测脑组织EB含量：RBC、WB、SO组6 h、1 d、3 d、5 d比较，其中在RBC第1、3天组明显高于6 h和5 d组，SICH后6 h开始升高，1 d达到高峰，3 d开始恢复，5 d有所下降(P<0.05)。结论 SICH后导致BBB功能障碍，红细胞对BBB结构破坏起至关重要的作用。

自发性脑出血；红细胞；血脑屏障;通透性

脑内出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指多种原因所致的大脑内血管破裂至脑实质内的出血，是临床上致残、致死率很高的神经系统常见的疾病之一。主要包括自发性脑内出血(spontaneous intracerebral hemorrhage，SICH)和创伤性脑内出血(traumatic intracerebral hemorrhage，TICH)。前者占所有脑卒中的44%以上，后者占头外伤的15%以上[1]。SICH在亚洲国家占脑卒中的20%～30%[2]，但病死率却最高，主要原因之一即脑水肿。研究认为[3]，SICH后血肿的占位效应、周围缺血、神经毒性以及血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的破坏可能在脑水肿的形成过程中起一定的作用。SICH后脑水肿是BBB通透性增高所导致的一种主要病理状态，在其持续发展的病理过程中又进一步加重BBB的损坏，因此脑水肿与BBB的状态密切相关。研究SICH后血肿中主要成分红细胞对脑水肿的影响以及与BBB通透性的关系，不但能为脑水肿形成的病理生理机制深入研究奠定基础，也会能为临床治疗SICH后脑水肿开辟新的有效途径。

本实验用鼠脑立体定向仪向大鼠右侧尾状核注射全血和红细胞液进行局灶性堆积制作SICH模型；在6 h、1 d、3 d、5 d 4个时段处死动物，处死前2 h经尾静脉注射依文思蓝(Evans Blue，EB)检测BBB通透性，以阐明在SICH后红细胞对BBB通透性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 脑立体定向仪；微量注射器；牙科磨钻；721型紫外分光光度计；电热恒温水浴锅；伊文思蓝；甲酰胺。

1.2 动物分组制作模型

1.2.1 动物分组：选用健康成年雄性清洁级SD大鼠80只，体质量210～300 g，均由河南科技大学医学院动物实验中心提供。将大鼠随机分4组：红细胞(red blood cell，RBC)组、全血(whole blood，WB)组、假手术(sham operation，SO)组、正常(normal group，NG)组，其中RBC组、WB组、SO组按照实验设计的处死时间(6 h、1 d、3 d、5 d)再分为4个亚组，每亚组5只，用于检测脑EB含量。

1.2.2 血液标本的制备：WB标本的制备：麻醉成功后，用38 ℃的温水加热鼠尾使尾部动脉扩张，从尾尖2 cm处剪断，用EP管取动脉血1 mL，以备用。RBC标本的制备：应用Xi等[4]的方法制RBC，将1 mL股动脉血依次：①500 r/min离心操作15 min；②移除离心管中上半层的血浆和RBC上的薄层乳糜状物质；③在剩余的RBC中加入5倍RBC体积的等渗盐水，500 r/min离心操作7 min，移去上清液；④将步骤③再重复2次，即得RBC；⑤将所得的RBC加等量等渗盐水，备用。

1.2.3 麻醉及SICH模型制作手术方法：① RBC组模型手术：根据大鼠体质量，用2%戊巴比妥钠按2 mL/kg行腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，俯卧位固定。调整立体定向仪，剃毛消毒，头部正中纵形切口长约1.0 cm，确定右侧尾状核位置(参照包新民等主编《大鼠脑立体定位图谱》)，即前囟前0.2 mm，正中线旁开3 mm，颅骨钻孔，直径约1 mm，微量注射器将大鼠自体红细胞液50 μL以10 μL/min的速度推注入脑(进针深度达硬膜下6 mm)，留针5 min后缓慢拔针。骨蜡封骨孔间断缝切口，消毒。② WB组制作：同RBC组方法，注射全血50 μL。③ SO组模型制作：同RBC组模型方法，进针后不往脑内注射任何液体，留针5 min。④ NG组麻醉成功后，不做处理，直接断头取材。

1.3 采集标本 在RBC、WB、SO 的3组模型完成后，按6 h、1 d、3 d、5 d时间点对各组大鼠处死并取材。

1.4 检测方法与指标 采用甲酰胺浸泡法[5]检测脑组织中EB含量。制作标准曲线：用精确度为0.1 mg的电子天平称取5 mg的EB加到25 mL容量瓶中，将等渗盐水加至25 mL，充分摇匀后用移液管吸取0.3 mL，加入到5.7 mL甲酰胺溶液里配置成第一管标准液，然后用移液管吸取第一管标准液3 mL，再加入3 mL甲酰胺溶液。如此程序依次配制8管标准液，其所含伊文思蓝(EB)的量依次是20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μg/mL。加橡塞密封后置入37 ℃水浴锅中孵育24 h。依次编号加入比色皿中，用紫外光光度计比色，测定各标准管中相应的光密度值(X)，并求出其与伊文思蓝(EB)含量(Y)的直线回归方程Y=29.029X-0.1178(R2=0.9999，P<0.001)。

应用甲酰胺浸泡法检测脑组织中EB的含量评定BBB损伤的程度。脑组织EB含量(μg/g湿脑)=A×甲酰胺量(mL)/脑组织湿质量(g)，其中A为根据标准曲线的回归方程求得的样本伊文思蓝(EB)的含量，结果以μg/g表示。

检测组在相应的时间点处死前经尾静脉注射2% EB溶液 2 mL/kg，观察眼结膜、暴露皮肤、四肢等处在数秒后被蓝染，表示注射EB的成功。2 h后灌注并断头取脑，冠状面切开取血肿周围脑组织约100 mg，用滤纸吸除表面水分，称取湿质量后，置于含5 mL甲酰胺溶液的试管中，加塞密封，37 ℃水浴锅中孵育48 h，离心取上清液，加入比色皿中，用721型紫外分光光度计在波长为632 nm处进行比色，测定其光密度(OD)值。根据预先设定的标准曲线，计算各组大鼠脑组织中EB含量。

1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS 21.0对实验结果进行分析，计量资料2组间采用独立样本t检验，多组采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 神经功能评分 待大鼠自然苏醒，按照Bederson评分法[6]判定制作的脑出血断模型是否成功(Ⅰ级：将大鼠尾巴提起，正常侧前肢向地面伸展，瘫痪侧前肢则回并收屈曲于腹下；Ⅱ级：除有Ⅰ级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较健侧明显减低；Ⅲ级：除有以上体征外，SD大鼠活动时躯体向瘫痪侧旋转)。

2.2 各组脑组织EB含量的变化 见表1。

2.2.1 组间比较：RBC组和WB组在第1天时EB含量明显高于SO组和NG组(P<0.05)，RBC组稍高于WB组(P<0.05)，而WB组亦明显高于SO组和NG组(P<0.05)，RBC组高于WB组(P<0.05)。

2.2.2 组内比较：RBC组第1天明显高于6 h、5 d(P<0.01)，稍高于3 d；RBC组第3天高于6 h、5 d(P<0.01)，RBC组第5天高于6 h(P<0.01)；WB组第1天明显高于6 h、5 d(P<0.01)，稍高于3 d，WB组第3天高于6 h 、5 d(P<0.01)，WB组第5天高于6 h(P<0.05)；SO以及NG组内相比无明显变化(P>0.05)。

表1 各组不同时间点脑组织EB含量的变化±s)

3 讨论

3.1 动物模型制作的意义 本课题主要探索SICH中红细胞与BBB通透性的关系。实验所选用的SD大鼠，因其与人类大脑发育以及结构形式基本近似[7-8]，最有利于研究本课题的基本条件，且价格低廉易于饲养，模拟人的SICH好发部位——尾状核的基底节区，定位也较容易。研究提示[9]，制作SICH模型时注入1 μL自体血相当于人类脑出血约0.75 mL。本研究课题注入50 μL制造相当于人类大脑约30 mL的出血量，从本次实验结果可以肯定制作的动物模型是符合实验要求标准的。因此，本课题所选用大鼠自体血脑内注射法制作SICH动物模型实验设计的成功，更符合模拟人类SICH的各项病理学特征。

3.2 SICH中红细胞对BBB功能的影响 通过检测脑组织EB含量，说明SICH后BBB通透性改变程度。EB作为染料制剂，与血浆白蛋白具有很高的亲和力，因此其常作为一种示踪剂在神经科学研究中检测观察BBB的通透性。正常情况下，血浆白蛋白无法穿过BBB，所以向血管内注入EB使血液染色，如果神经系统中的BBB是完整的，血液中的EB无法通过BBB进入脑组织，则无法使脑组织蓝染；如果BBB结构被破坏，EB可以通过BBB进入脑组织而使之着色蓝染。所以，通过检测脑组织中EB的含量，证明BBB通透性的变化，进而反映SICH后脑水肿的严重程度与BBB破坏的关系[10-11]。

本实验结果表明，RBC组、WB组、SO组在SICH后的第6小时，脑组织中的EB含量开始升高；SICH后第1天时，RBC组EB含量最高达(161.607±6.376)μg/g，比其他各分组明显高；SICH后第3天时，RBC组EB含量仍处于较高水平，但已经趋于平稳；SICH第5天时各组EB含量已开始下降，但仍高于其他时间点。WB组在SICH后第1天时，EB含量显示最高，可达(154.35±4.658)μg/g，明显高于假手术组；在第3天时趋于平稳，但仍较高，在SICH第5天时EB含量开始下降，可以看出WB组与RBC组的EB含量呈动态变化，但WB组各时间点均低于红细胞组。而SO组、NG组EB含量在各时间点均无明显变化。4组EB含量比较发现，RBC组1 d明显比SO组、NG组高(P<0.01)，WB-1 d组高于SO-1 d组(P<0.05)，RBC-1 d组比WB-1 d组含量高(P<0.05)，SO组、NG组比较无显著差异(P>0.05)。提示RBC-1 d组的脑组织EB含量比其他各分组明显增高。

在SICH后血肿中的RBC所产生的毒性物质与BBB的通透性之间关系密切，呈正相关。说明BBB的通透性的改变对SICH后脑水肿的形成起至关重要的作用，研究和了解BBB通透性与血肿中RBC之间的关系，认识其在健康和疾病时的功能改变对神经系统疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。

[1] Siddique MS, Gregson BA, Fernandes HM, et al.Comparative study of traumatic and spontaneous intracerebral hemorrhage[J].J Neurosurg, 2002,96(1):86-89.

[2] 饶明俐.中国脑血管病防治指南[J].中风与神经疾病杂志,2005,22(5):388-393.

[3] Shi BZ, Meng XF, Yang JX, et al.Effect of erythrocytes on brain water content and haem oxygenase-1 expression in rats with traumatic intracerebral haemorrhage[J].Acta Neurochir (Wien), 2012,154(6):1 081-1 086;1 086.

[4] Xi G, Keep RF, Hoff JT.Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebral hemorrhage in rats[J].J Neurosurg, 1998,89(6):991-996.

[5] Belayev L, Busto R, Zhao W, et al.Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Brain Res, 1996, 739(1/2):88-96.

[6] Broderick JP, Brott TG, Duldner JE, et al.Volume of intracerebral hemorrhage.A powerful and easy-to-use predictor of 30-day mortality[J].Stroke, 1993,24(7):987-993.

[7] Semple BD, Blomgren K, Gimlin K, et al.Brain development in rodents and humans:Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species[J].Prog Neurobiol, 2013(106/107):1-16.

[8] Bayer SA, Altman J, Russo RJ, et al.Timetables of neurogenesis in the human brain based on experimentally determined patterns in the rat[J].Neurotoxicology, 1993,14(1):83-144.

[9] 何纲,刘茂才.实验性脑出血动物模型的研究进展[J].国外医学·神经病学神经外科学分册,2001,28(2):80-83.

[10] 胡全美,虞佩兰,吴中匡,等.兔脑水肿模型脑组织伊文思兰定量测定[J].湖南医学院学报,1984,9(2):131-136.

[11] Manaenko A, Chen H, Kammer J, et al.Comparison Evans Blue injection routes:Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model[J].J Neurosci Methods, 2011,195(2):206-210.

(收稿 2015-03-12)

河南科技大学青年科学基金(项目编号：2010QN0037)

R-332

A

1673-5110(2016)07-0021-02