乌司他丁对控制性降压诱导的缺血缺氧脑损伤Caspase—3表达及凋亡程度

张超城 肖晓山

【摘要】 目的：观察乌司他丁对控制性降压诱导的缺血缺氧脑损伤Caspase-3表达及凋亡程度。方法：60只新西兰大白兔随机分成5组，每组12只：正常组（Ⅰ组），控制性降压组（Ⅱ组，平均动脉压降至基础值的45%组），乌司他丁降压前给药组（Ⅲ组，控制性降压前30min静注乌司他丁10*104IU/kg），乌司他丁降压后给药组（Ⅳ组，控制性降压开始后30min静注乌司他丁10*104IU/kg），乌司他丁降压前+降压后给药组（Ⅴ组，控制性降压开始前30min和开始后30min均静注乌司他丁10*104IU/kg）。各组在硝普钠降压一个小时后，停止降压2小时后处死，取出海马组织。TUNEL检测海马凋亡细胞，用Western-blot检测海马组织casspase-3。结果：1、Western-blot检测：与II组比较，三组用药组（III、IV、V组）Caspase-3表达显著减少（P<0.01）；与III、IV组比较， V组Caspase-3表达减少（P<0.05）。与II组比较，用药三组调亡指数减少（P<0.01）。2、TUNEL检测：与II组、III组、IV组、V组比较，显示I组调亡指数最少的（P<0.01）。与III组、V组比较，显示IV组的调亡指数有所增加（P<0.05）。结论：1、乌司他丁对控制性降压引起脑缺血缺氧脑损伤是有保护作用，其可能抑制Caspase-3的表达，减少神经细胞凋亡有关；2、在三组给药的不同时段比较中，降压前+降压后给药组（V组）Caspase-3的表达最少；由此说明，推荐的给药方法是降压前和降压后同时给药。

【关键词】乌司他丁；控制性降压； 缺血缺氧脑损伤； casspase-3

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）02-0014-02

控制性降压是在手术中常用的技术。同时控制性降压也会带来风险，有学者报导在控制性降压出现脑损伤等[1-2]。关于不同的控制性降压水平对兔海马CA1神经元影响的研究[3]结果显示MAP降至基础值的45%，兔海马CA1神经元凋亡程度最严重，因此本研究以MAP降至基础值45%，以观察乌司他丁对控制性降压诱导的缺血缺氧脑损伤Caspase-3表达及凋亡程度以指导临床应用。

1 资料与方法

1.1 实验材料

实验动物 清洁级新西兰雄性大白兔，体重1.8-2.2kg。

实验药物及试剂 乌司他丁、TUNEL试剂盒、Caspase-3。

1.2 实验方法

分组及给药方法 健康新西兰白兔60只，雄性，体重1.8-2.2Kg，由南方医科大学实验动物中心提供。60只健康新西兰白兔，随机分成5组，每组12只：正常组（I组），控制性降压组（II组，平均动脉压[MAP]降至基础值的45%组），乌司他丁降压前用药组（III组，控制性降压前30min静脉注射乌司他丁10*104U/kg），乌司他丁降压后用药组（IV组，控制性降压开始后30min静脉注射乌司他丁10*104U/kg），乌司他丁降压前+降压后用药组（V组，控制性降压开始前30min和开始后30min均给予静脉注射乌司他丁10*104U/kg）。

动物模型 氯胺酮50 mg/kg复合1mg/kg力月西肌注麻醉（术中肌注氯胺酮20 mg/kg/30min）。沿颈中正切开，分离气管，插入气管导管，接呼吸机机械通气（潮气量21ml，呼吸51bpm，FiO21.0）。分离颈内静脉、穿刺置管，接延长管输液通路并输液（8ml/kg）。在兔腹股沟下缘分离股动脉并穿刺置管，接测压转换器并开始动脉测压。正常组采用5%葡萄糖注射液4ml/ （kg*h） 连续泵注；降压组及治疗组均采用5%葡萄糖液配制的硝普钠（400ug/ml）开始泵注，10-15分钟内降至目标血压，维持目标血压l h。根据上述分组方案，给予乌司他丁。降压完毕后，实验动物复压2 h后处死。

1.3 标本采集与处理 每组动物中的一半用于灌注固定：降压停止后2h，打开胸腔暴露心脏，由心尖进针插入升主动脉（同时钳夹腹主动脉，剪开右心耳），快速滴注37℃生理盐水500ml，无血污后改为滴注4%多聚甲醛固定液500mL，先在5min内灌入约100ml，余液在25分钟内灌完。开颅取出1mm及4mm海马组织，切取右边1mm3置于4%多聚甲醛液中后固定，剩余组织放置于中性甲醛溶液中固定、梯度乙醇脱水、包埋、切片、捞片、烤片。每组中另外一半动物在复压2h后处死，迅速取出海马组织，在-80℃冻存，用于Western Blot检测。

1.4 标本检测方法

1.4.1 Western-blot检测Caspase-3的表达

剪碎组织，与裂解液1：5混合，取上均浆。离心，取上清液；使用Bradford法进行蛋白质定量，然后12%SDS-PAGE电泳分离，依marker指示，将测蛋白转PVDF膜上；封闭液4℃过夜，抗Caspase-3抗体1：1500稀释与PVDF膜温2H，加入二抗，ECL反应2min，将蛋白印迹曝光在X光胶片上。结果使用Gel-Pro Analyzet4.0进行分析。以GAPDH为内参。

1.4.2 TUNEL检测凋亡细胞

将冰冻组织切片固定10min，PBS 漂洗10*2min。再置乙醇：乙酸（2：1）溶液-20℃处理5min。PBS 漂洗10*2min。2% H2O2浸泡5min。PBS洗涤10*2min。滴加TdT酶反应液，37℃孵育1h（阴性染色对照，加不含TdT酶的缓冲液替代）。滴加两滴过氧化物酶标记的地高辛抗体，室温孵育30min。PBS洗涤10*2min。DAB显色3～6min。蒸馏水洗5*3min。甲基绿复染10min。蒸馏水洗5*3min，再用100%正丁醇5*3min。常规脱水、透明和封片。在400倍光镜下观察海马组织病理学改变。随机选取6个视野，按照（TUNEL阳性神经细胞/神经细胞总数）×100%计算海马神经细胞的凋亡指数。

1.5 统计学处理

各组数据应用SPSS13.0进行分析。所有计量资料进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05，认为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 Western-blot检测Caspase-3的表达

与控制性降压组（II组）比较，三组用药组（III、IV、V组）Caspase-3含量显著减少（P<0.01）；V组与III、IV比较，显示V组Caspase-3含量减少（P<0.05）。结果如下图：

2.2 TUNEL检测凋亡细胞

与II组比较，III、IV、V组三组调亡指数减少（P<0.01）。II、III、IV、V组与I组比较，P<0.01，显示正常组调亡指数最少的。IV组与III、V组比较，P<0.05，显示IV组，调亡指数有所增加。

3 讨论

脑血流有自动调节功能，但是这种自我调控功能和耐受性的平均动脉压的安全低限存在明显的个体差异。同时脑的生理特性也是脑缺血缺氧易损伤的原因之一。当控制性降压引脑灌注压明显下降时，极易使脑缺血缺氧而受到损害[4-5]。

脑缺血缺氧会引起促进细胞凋亡[6]。参与凋亡过程相关的基因有几十种，其研究较多的如Bcl-2家族[7]、即早基因[8]、caspase家族[9]等。其中，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。在凋亡级联反应中，Caspase-3是最为主要的，在神经元细胞凋亡过程中起着决定性作用[10]。

本实验中，Western blot检测Caspase-3显示给药三组（III组、IV组及V组）与控制性降压组比较，三组用药组Caspase-3的含量显著减少，说明用药后，Caspase-3的表达是减少的，减轻了神经细胞凋亡反应。乌司他丁降压前+降压后用药组Caspase-3的表达，明显少量其它用药二组，说明V组乌司他丁的用药方法更好的抑制Caspase-3的表达，减轻了神经细胞凋亡。同时在凋亡指数中正常组的神经海马细胞的凋亡指数是最少的，而控制性降压组的凋亡指数是最严重的。同时，与控制性降压组比较，用药三组凋亡指数降压，说明乌司他丁有效减轻控制性降压引起的脑缺血缺氧脑损伤的细胞凋亡。而用药三组之间比较显示，降压后给药组细胞凋亡更严重。说明在用药三组比较，降压后给药，神经细胞凋亡比较多。

综上所述，乌司他丁对控制性降压引起脑缺血缺氧脑损伤是有保护作用，其可能抑制Caspase-3的表达，减少神经细胞凋亡有关；在三组给药的不同时段比较中，降压前+降压后给药组Caspase-3的表达最少；由此说明，推荐的给药方法是降压前和降压后同时给药。

参考文献：

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