毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能1)

王含　魏明　　　　　　　　李成浩

(东北林业大学，哈尔滨，150040)　　　　(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))



毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能1)

王含魏明李成浩

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

摘要为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律，从毛果杨基因组DNA中克隆出PtAREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明，该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上，构建了PtAREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体，利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明PtAREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、MeJA和SA胁迫下，驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明PtAREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。

关键词毛果杨；ABF转录因子；ABA；启动子；拟南芥

分类号Q78

Cloning and Functional Identification of Promoter Region ofPtAREB1 fromPopulustrichocarpa

Wang Han, Wei Ming

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Li Chenghao(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：18-24.

In order to study the expression and regulation of ABF homologous gene in poplar, a 1 800 bp 5’flanking sequence ofPtAREB1 gene was isolated by PCR from genomic DNA ofPopulustrichocarpa. By promoter sequence analysis, the sequence contained stress-response element TC-rich, ABA-response element ABRE and MeJA-response element TGACG-motif. By sequence analysis, thePtAREB1 promoter was fused to the GUS reporter gene to characterize its expression pattern inP.trichocarpa. From theAgrobacteriummediated transformation ofArabidopsisthaliana, the GUS gene was induced inArabidopsisthaliana, and it expressed in roots, stems and leaves under ABA, drought, high salt, MeJA and SA, suggesting thePtAREB1 promoter was responsive to ABA, drought and high salt stress.

KeywordsPopulustrichocarpa; ABF transcription factor; ABA; Promoter;Arabidopsisthaliana

脱落酸(abscisic acid，ABA)是一种非常重要的植物激素，它的主要作用是在胁迫下对植物营养组织适应性有基础调节作用，如干旱和高盐等[5-6]。在逆境下转录因子作用于启动子调控下游基因上调或下调的表达[7]，大多数受ABA诱导的基因在启动子区域都有保守序列(C/T)ACGTGGC序列ABRE(ABA responsive element)顺式作用元件[8]。ABA反应元件结合蛋白/AREB结合因子(AREB/ABF)基因亚家族包含在ABA介导的信号通路中的关键转录因子。ABFs(ABRE blinding factors)可以在非生物胁迫下激活ABRE相关基因的表达，提高植物非生物胁迫耐受性。

近几年来，在模式植物研究中ABF转录因子已成为热点。ABF基因在诸多非生物胁迫中被特异性诱导表达。有研究从拟南芥中分离出4种ABF转录因子，其中ABF1主要参与低温、ABA胁迫应答反应；ABF2/AREB1、ABF4/AREB2则主要参与ABA、干旱、高盐、热和氧化胁迫应答反应，ABF3主要受ABA、高盐、低温、热、氧化胁迫诱导[9]。目前与植物逆境胁迫相关的特异性表达启动子的研究主要集中在拟南芥(Arabidopsisthaliana)[10]、烟草(Nicotianatabacum)[11]等草本模式植物和棉花(Cotton)[12]、玉米(Zeamays)[13]、谷类植物(Cereal)[14]等农作物上，而关于多年生木本植物，尤其对杨树逆境胁迫相关的特异性表达启动子的研究少有报道。

本文从毛果杨中克隆ABF2同源基因PtAREB1的启动子序列，对其顺式作用元件进行分析，构建pCAMBIA-1303::GUS植物表达载体，利用花粉管通道法[15]转拟南芥对该启动子的表达特性进行研究。

1材料与方法

用于提取植物基因组DNA的毛果杨(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)取自东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态DH5α，根癌农杆菌菌株EHA105菌株(本实验室保存)。植物表达载体pCAMBIA-1303::GUS。克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。

主要试剂：植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒以及普通质粒小提试剂盒购自康为世纪公司；LATaq酶、核酸分子量标准(DNA marker ladder)、T4-DNA连接酶、限制性内切酶BamHI和NcoI等购自TaKaRa公司；卡那霉素(Kanamycin)购自Amresco公司；氨苄霉素(Ampicillin)购自Sigma公司；利福平(Rifampicin)购自MYM公司；乙酰丁香酮(Acetosyringone)购自Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、酵母提取物、NaCl和琼脂等其余试剂均为国产分析纯。

1.1毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆

以毛果杨叶片为材料用CTAB法提取基因组DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。根据毛果杨PtAREB1基因(POPTR_0001s22790)5′端序列为基础设计引物，上游引物5′GCGGATCCTTGCGATCATCATTTGTT(划线部位为增加的BamHI酶切位点,酶切位点前加两个保护碱基)，3′下游引物ATCCATGGTCACCATCAAACTCTTAACC(划线部位为增加的NcoI酶切位点,酶切位点前加两个保护碱基)。以毛果杨基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)。20 L PCR反应体系包括：2 μL(100 ng)毛果杨基因组DNA、2 μL 10×LA PCR缓冲液、1.6 μL(2.5 mmol·L-1)dNTP、0.4 μL 10-5m·L-1上游引物、0.4 μL 10-5m·L-1下游引物、0.2 μLLATaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、13.4 μLddH2O2。PCR反应循环条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

2018年8月28日上午7：00左右接本镇养殖户王先生咨询电话：池塘鱼在一次拉网取样后，零星死亡，用药后3～4天不吃食，为什么？拉网吓的？因王先生今年刚从其叔叔手中接过池塘，是养殖新手，笔者决定到现场实地看看。

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，使用凝胶回收试剂盒回收、纯化目的片段。参照TaKaRa公司pMD18-T Vector试剂盒的说明将目的片段连接到pMD18-T Vector上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种到含氨苄霉素(50 mg·L-1)的LB固体培养基平板上，1 L LB固体培养基含有10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和12 g琼脂，37 ℃倒置培养14～16 h，挑取单菌落进行PCR获得阳性克隆。阳性克隆委托吉林省库美生物科技有限公司公司进行测序。

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件对其转录调控元件进行分析。

1.2植物表达载体构建

将pCAMBIA-1303::GUS质粒进行BamHI和NcoI双酶切，同时将基因重组质粒进行BamHI和NcoI双酶切，回收纯化目的片段,通过T4-DNA连接酶连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞5α，新的重组质粒经氨苄霉素(50 mg·L-1)和PCR筛选后，获得PtAREB11303::GUS植物表达载体，通过电击法将PtAREB11303::GUS表达载体转化到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，经菌液PCR和双酶切鉴定，获得阳性克隆,完成工程菌制备。

1.3农杆菌介导的花粉管通道法转化拟南芥

用花粉管通道法将拟南芥花絮放入已经用蔗糖水悬浮的农杆菌菌液中(OD=0.8～1.2)浸泡3 s。取出即可。侵染完成后，将拟南芥用保鲜膜包好，并用不透光塑料袋遮盖上，暗培养16～24 h，取下袋子和保鲜膜，正常光照培养。侵染一周后，按照上述方法进行二次侵染。待角果成熟发黄后，收集T0代种子。37 ℃烘箱中，烘干2 d，放入4 ℃中，3～5 d后，可以筛选种子。进行种子消毒后，播种于含50 mg·L-1Kan的1/2MS培养基中，种子萌发生长后，取抗性植株种于土壤中，成熟后收种子T1代并通过PCR鉴定出转基因植株。重复以上步骤，筛选出T3代转基因株系。

将T3代转基因种子用20%白猫消毒25 min，蒸水清洗干净，均匀播种在添加50 mg·L-1Kan的1/2MS培养基上。将生长10 d的转基因植株分别转移至含200 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1甘露醇、150 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)、100 μmol·L-1水杨酸(salicylic acid，SA)的培养基上进行幼苗期ABA、干旱、盐、MeJA和SA胁迫处理，2 d后取样。取处理后的植株进行GUS组织化学染色分析，37 ℃染色20 h，然后用70%乙醇脱色，观察并拍照，GUS染色液的配制：称取0.5 mg X-Gluc，加入1-2滴DMF使之完全溶解，再加入980 μL磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1)，10 μL铁氰化钾(5 mmol·L-1)，10 μL亚铁氰化钾(5 mmol·L-1)，搅拌均匀后加入1 μL TritonX-100。

2结果与分析

2.1毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆

以毛果杨基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到大小约为1.8 kb的片段(图1)，与预期基本一致，将此片段回收，与pMD18-T载体连接,经菌液PCR验证后,证明该启动子片段已克隆到pMD18-T载体上。阳性克隆测序结果表明，该序列长度为1 800 bp。

M.DL5000 DNA Marker;1.PtAREB1基因启动子PCR扩增。

2.2PtAREB1基因启动子的序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对其转录调控元件进行分析(图2，表1)。结果表明，该基因启动子区域中有保证转录精确开始的TATA-box启动子核心元件、控制转录效率和频率的CAAT-box元件。另外，还有G-Box、GT1-motif和Box 4等光应答相关的元件、厌氧诱导反应过程中的顺式作用元件ARE和茉莉酸甲酯应答元件TGACG-motif。特别是，启动子中还存在逆境胁迫响应元件TC-rich repeats和ABA应答元件ABRE。

图2　毛果杨PtAREB1基因启动子序列

元件名称核心序列功能注释ABRETACGTGABA应答元件AREGGTTT厌氧诱导元件TGACG-mo-tifTGACG茉莉酸甲酯应答元件TC-richre-peatsATTTTCT-TCA逆境胁迫响应元件ACEACGTGGA光应答元件ATCT-motifAATCT-GATCG光应答元件BoxITTTCAAA光应答元件G-BoxTACGTG光应答元件GT1-motifGGTTAA光应答元件Sp1CC(G/A)CCC光应答元件GAG-motifGGAGATG光应答元件Box4ATTAAT光应答元件CCGTCC-boxCCGTCC植物分生组织相关元件CAAT-BOXCAAAT核心元件

2.31303-PtAREB1-GUS植物表达载体的构建及工程菌的制备

新的重组质粒经菌液PCR验证后得到1.8 kb片段(图3A)，与预期吻合，获得植物表达载体PtAREB11303::GUS。电转农杆菌后，菌液PCR鉴定结果(图3B)，质粒双酶切结果(图3C)，表明载体构建成功。

2.4转基因拟南芥植株的获得

用花粉管通道法侵染野生型的拟南芥，收获的种子在添加50 mg·L-1Kan的1/2MS固体培养基上筛选转染成功的植株，直到筛选到T3代得到8个转基因株系，并用GUS特异的引物进行PCR验证，能扩增出相应条带(图4)，证实是转基因成功的植株。用于GUS染色。

A.重组质粒PCR鉴定;B.电转后菌液PCR鉴定;C.重组质粒双酶切鉴定;M1.DL5000 DNA Marker;M2.DL2000 DNA Marker;M3.DL15000 DNA Marker;1.重组质粒PCR产物;2.电转后菌液PCR产物;3.植物表达载体BamHI和NcoI双酶切产物。

图3PtAREB1-GUS植物表达载体的构建

M.DL5000 DNA Marker;+.重组质粒PtAREB11303::GUS为模板的PCR产物;-.野生型拟南芥DNA为模板的PCR产物;1～8.PtAREB11303::GUS转基因拟南芥T3代DNA。

图4T3代DNA水平PCR检测

2.5PtAREB1基因启动子的GUS组织化学染色

为了研究该启动子在不同胁迫条件下的组织特异性表达，将构建好的PtAREB11303::GUS表达载体通过农杆菌介导的花粉管通道法转入拟南芥，对转入该启动子的拟南芥幼苗进行200 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1甘露醇、150 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1SA胁迫处理，对

不同胁迫处理的植株进行GUS组织化学染色分析。以未经胁迫处理的转基因植株做为对照。结果如图5所示，在未经胁迫的转基因植株中没有检测到GUS表达。在甘露醇、ABA、盐、MeJA和SA胁迫下，转基因植株的根、茎和叶均能被X-Gluc不同程度的染成蓝色。GUS表达模式在ABA和甘露醇胁迫下，被观察到在转基因植株根、茎中部和叶；在盐胁迫下被观察到在转基因植株根部、茎下部和叶；在MeJA和SA胁迫下，被观察到在转基因植株根、茎上部和叶，其中SA胁迫下转基因植株根和茎上部、MeJA胁迫下转基因植株茎上部的GUS表达活性较高。值得一提的是，在ABA和甘露醇胁迫下，在转基因植株根、茎中部和叶的GUS表达活性较高，与其他胁迫相比被X-Gluc染色加深。从总体来看，甘露醇、ABA、盐、MeJA和SA胁迫能促使PtAREB1启动子驱动GUS报告基因的表达。

A.未处理;B.200 mmol·L-1甘露醇;C.200 μmol·L-1ABA;D.150 mmol·L-1NaCl;E.100 μmol·L-1MeJA;F.100 μmol·L-1SA。

3结论与讨论

杨树是我国重要的造林绿化、工业用材树种。杨树人工林在我国特别是北方的生态建设和商品林建设中占有不可替代的地位。气候引起的干旱和气温升高导致了全球大范围的树木死亡，所以研究植物抗旱性成为林木育种的首要任务。植物在干旱条件下至少有4条信号转导途径，其中2条信号途径依赖ABA[16]。ABA在植物干旱适应中很重要，大量研究表明ABA含量可作为评价植物抗早能力的指标之一[17]。AREBs是ABA反应元件结合蛋白。ABF转录因子应答受不同的胁迫条件影响，比如，ABF1受低温影响应答，ABF2和ABF3受盐胁迫影响应答反应，而ABF4受低温、盐、和干旱条件影响应答反应。OsbZIP46是ABF转录因子同源性较高的基因，过表达OsbZIP46水稻对ABA敏感，在干旱下高效表达[18]。盐芥ABFs家族中14-3-3亚族转录因子对于基因在逆境表达有调控作用，推测其同样会改变拟南芥中基因的逆境表达[19]。

启动子包含了很多顺式作用元件，保证了基因正常调控，从而使植物在不同环境下生长发育得以高效进行。不同的顺式元件以相应方式调控着功能性基因，如干旱响应启动子包含ABA应答因子(ABRE)和保守的干旱响应元件(DRE)，保证调控耐旱性基因高效表达。本文构建了PtAREB1基因的启动子融合GUS表达载体通过GUS活性来进行PtAREB1启动子功能的研究。PtAREB1基因与ABF2同源，由此推测PtAREB1与ABF2基因功能相似。为了初步预测PtAREB1可能参与的生物功能，对其启动子序列进行顺式作用元件预测分析，在启动子区域发现厌氧诱导反应过程中必不可少的顺式作用元件ARE，抗病和逆境胁迫响应作用元件TC-rich repeats，另外还发现了G-Box、GT1-motif和Box 4等多种光响应元件，与激素相关的原件茉莉酸甲酯应答元件TGACG-motif。还包含了5′UTR区，有研究表明5′UTR区对基因的表达调控起着重要作用[20]。最重要该启动子含有干旱与ABA应答相关的ABRE顺式作用元件。初步猜测PtAREB1可能与逆境胁迫下植物应答相关，为PtAREB1基因功能预测在理论上起到一定作用。本实验对不同胁迫处理的植株进行GUS组织化学染色分析，结果发现在甘露醇、ABA、盐、MeJA和SA胁迫下，PtAREB1启动子驱动GUS报告基因的表达且GUS表现较高活性，表明PtAREB1基因可能被甘露醇、ABA、MeJA和SA调控。已有研究证明PtAREB1的同源基因ABF2在ABA、高盐等胁迫下均上调表达[21]。由于PtAREB1基因启动子中含有MeJA应答元件，PtAREB11303::GUS转基因拟南芥在MeJA胁迫下应答反应明显。有研究表明MeJA可作为内源信号激发植物防御反应[22]。在SA胁迫下PtAREB11303::GUS转基因拟南芥有明显的应答反应。研究表明SA是可介导植物局部组织器官或全身在环境胁迫下产生防御反应的重要内源信号[23]。研究中发现，甘露醇、ABA、盐、MeJA和SA胁迫可促使PtAREB1启动子驱动GUS报告基因在拟南芥根、茎和叶片的表达，推测逆境胁迫下PtAREB1基因在毛果杨的根、茎和叶片可能会被诱导表达。在不同胁迫下，GUS被检测到在PtAREB11303::GUS转基因拟南芥的茎部表达区段不同，推测PtAREB1基因在毛果杨茎不同部位的表达机制可能不同。bZIP转录因子家族中TaABP1基因在小麦中受ABA、高盐、低温和干旱诱导表达，在根、茎和叶中都有表达，但茎中表达量最高[24]。值得一提的是，在ABA和甘露醇胁迫下，转基因植株叶的GUS表达活性较高，与其他胁迫相比被X-Gluc染色加深，猜测PtAREB1启动子可能在保卫细胞中表达，之前ABF2启动子被报道其在保卫细胞中表现较高活性[25]。从而推测该基因可能通过ABA依赖途径来控制叶片气孔开关。有研究表明AREB亚族基因TaABL1受ABA调控表达并加快转基因小麦在胁迫下气孔的关闭速度[26]。研究表明气孔的关闭受应激激素ABA介导，在干旱条件下ABA可调节控制气孔关闭的信号，从而使植物耐旱性提高[27]。

在甘露醇、ABA、盐、MeJA和SA胁迫下，PtAREB1基因启动子驱动GUS报告基因在转基因拟南芥中表现出不同活性，说明该基因启动子是逆境胁迫诱导表达型启动子，启动子通过与转录因子结合控制基因活动，意味该基因表达可能受非生物胁迫的调控。逆境胁迫下PtAREB1启动子驱动GUS报告基因在拟南芥中特异性表达的这些研究结果，为今后研究PtAREB1基因转基因杨树在逆境胁迫过程中应答反应机理奠定了基础。

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收稿日期：2015年10月30日 。

作者简介：第一王含，女，1993年12月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail:wanghan_93@163.com。通信作者：李成浩，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，教授。E-mail:chli0@163.com。

1)国家“863”计划重点项目(2013AA102704)。

责任编辑：潘华。