落叶松胚性愈伤组织诱导与未成熟胚形态的关系1)

宋跃　张含国　李淑娟　　　　　李树久

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)　　　(肇州县林业局)



落叶松胚性愈伤组织诱导与未成熟胚形态的关系1)

宋跃张含国李淑娟李树久

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)(肇州县林业局)

摘要以13落叶松未成熟胚为材料进行胚性愈伤组织的诱导，其中，长73-44、日5*、日5、日5×长77-1、日5×兴9、日12×兴9等6个家系诱导出胚性愈伤组织，7月1日采集的日5×长77-1未成熟胚的胚性愈伤诱导率最高，达13.93%。研究结果表明，不同采集时间的落叶松合子胚形态存在一定区别，诱导出的愈伤组织形态也有所不同，其胚性愈伤组织诱导明显受到取材时间及家系的影响。落叶松胚胎发育存在多胚现象，胚性愈伤组织的诱导率与散粉后时间及胚胎长度呈负相关，而与多胚发生率呈显著正相关(p=0.028)。

关键词落叶松；日本落叶松；长白落叶松；杂种落叶松；未成熟合子胚；胚性愈伤组织

分类号Q943.1；S791.22

Relationship between the Induction of Embryogenic Callus of Larch and the Morphology of Immature Embryos

Song Yue, Zhang Hanguo, Li Shujuan

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Li Shujiu(Forestry bureau of Zhaozhou)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：25-30.

With immature embryos for embryogenic callus induction, we induced embryogenic callus from zygotic embryos ofLarixolgensis73-44,L.kaempfer5*,L.kaempferi5,L.kaempferi5×L.olgensis77-1,L.kaempferi5×L.gmelinii9 andL.kaempferi12×L.gmelinii9. The embryogenic callus induction of immature embryos ofL.kaempferi5×L.olgensis77-1 was the highest in July 1 st, which was 13.93%. There was a certain difference in the morphology of the different acquisition time of the larch, and the callus formation was different and the callus induction was significantly influenced by the time and the family. Polyembryonic phenomenon was in the development of larch embryos. The embryogenic callus induction rate was negatively correlated with loose powder after days and embryo length, and was a significant positively correlated with polyembryonic occurrence rate (P=0.028).

KeywordsLarix;Larixkaempferi;Larixolgensis; Hybrix larch; Immature zygotic embryos; Embryogenic callus

落叶松(Larixssp.)属于松科(Pinaceae)中的落叶松亚科(Laricoideae)落叶松属(Larixmill)，具有分布广、抗逆性强及早期速生等优点，为北半球温带山区与寒带气候条件下重要的速生用材树种，具有很高的生态价值与经济价值。但是落叶松生长周期长，扦插等无性繁殖存在生根率较低等问题，且落叶松具有杂合度高的特点，有性生殖产生的子代存在变异，很多优良性状难以维持[1]，通过传统的繁育方法并不能很好的满足良种生产的需求，所以利用现代生物技术手段，建立稳定且高效的落叶松再生体系如体胚发生体系对于落叶松优良种质的繁育有积极意义，而胚性愈伤组织的诱导是体细胞胚发生体系建立的关键环节。

目前，有关于胚性愈伤组织的报导主要集中于胚性愈伤组织诱导过程中的影响因素[2-3]，影响胚性愈伤组织增殖的因素[4]及如何通过胚性愈伤组织诱导体细胞胚胎[5-13]等几个方面，而对于落叶松种间及其杂种的胚性愈伤组织诱导率的差异，以及胚性愈伤组织诱导率与未成熟胚形态发育间的关系则鲜见报道。因此，本研究以13个自由授粉家系的6种落叶松的未成熟胚作为外植体进行胚性愈伤组织的诱导，并对其中胚胎发育过程具有代表性的两个家系，即同步性较好的日5及同步性较差的日12×兴9各时期未成熟胚进行形态的观察及对比，试图揭示落叶松未成熟胚的形态发育与胚性愈伤组织诱导间的关系，为落叶松的体胚研究提供技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

采种母树为选自黑龙江省林口县青山种子园13个家系的14株优良单株，分别是兴12、兴5×兴9、日5、日5*、长73-44、日5×长77-1、日5×长77-1 CA-1、日5×长77-1 CA-2、日5×长77-3 CA-2、日5×长77-3 CA-3、日3×长75-5 CB-A、日5×兴9、日12×兴9及兴9×日76-2。上述各母树的生长坡度均为24°～25°，其中包括兴5×兴9及日×长杂种落叶松在内的7个家系的生长坡向朝北，而其余各家系坡向朝东。

2015年春季对青山种子园落叶松散粉规律的调查结果显示，落叶松种间散粉期不同，但各种间杂种的散粉期却趋于一致。其中，兴安落叶松散粉期最早，为4月21—22日；杂种落叶松和长白落叶松的散粉期较之稍晚，为4月24—25日；而日本落叶松的散粉期更晚，为4月27—28日。

供试材料分别于2015年6月24日、7月1日、7月8日及7月15日采集。采下的大孢子叶球用塑料密封袋密封后，放入冰盒内保存并运输至实验室，储藏于冰箱内4 ℃备用。

1.2试验方法

1.2.1未成熟胚的形态学观察

将不同时间采集的日5、日12×兴9两个家系大孢子叶球的种鳞去除，选择饱满的种子，剥除外皮后，分别随机选取其中10粒未成熟的种子进行称重，重复3次。然后用镊子将胚挑出，显微镜下观察胚的发育状态、测量胚的长度、统计每粒种子中胚的数量并计算多胚发生的概率。上述数据均采用PASW Statistics 18软件进行统计分析。

1.2.2外植体的消毒及接种

超净工作台内，将剥好的种子先经无菌水漂洗3次，转入75%酒精处理1 min；再用无菌水漂洗3次，3%的NaClO处理10 min；最后无菌水漂洗3次，接种备用。

接种前，外植体表面水分用无菌滤纸吸干。接种方法有2种，一种为纵向划破胚乳至胚，不将种胚单独挑出而直接接种于培养基中；另一种为纵向划破胚乳至胚，并挑其种胚，但不使其与胚乳完全分离，将胚与胚乳一同接入培养基中(图1)。两种方法处理的胚乳切口均向下朝向培养基。6月24日及7月1日采集的材料，其胚不易挑出所以选用第一种方法接种；7月15日采集的外植体已发育至形态学成熟故选用第二种方法接种；而7月8日采集材料的发育状况介于上述两者之间，接种时根据胚的发育情况，酌情选择接种的方式。

方法1(纵向划破胚乳至胚，不将种胚单独挑出而直接接种于培养基中)；方法2(纵向划破胚乳至胚，并挑其种胚，但不使其与胚乳完全分离，将胚与胚乳一同接入培养基中)。

图1外植体的接种

1.2.3胚性愈伤组织的诱导

将不同处理的外植体分别接种于含有1.5 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT的BM培养基上，每个处理重复3次，每次重复接种15个外植体，并分别进行标记。(25±1)℃条件下进行暗培养。接种后观察外植体变化，4～8周后分别进行愈伤诱导率及胚性愈伤诱导率的统计。

2结果与分析

2.1未成熟胚的形态学观察

贾桂霞等[14]认为，落叶松胚胎的发育要经过原胚阶段，胚胎选择及发育阶段和成熟阶段。因为落叶松胚胎的形态结构在发育过程中变化明显，所以根据胚在发育和分化阶段形态的变化，本研究将试验中观察到的合子胚分为5个阶段(图2)：1、子叶前期Ⅰ，即已形成次生胚柄，但幼胚仅由少量的十几个细胞组成；2、子叶前期Ⅱ，幼胚细胞不断分裂增殖，已成为一圆柱体；3、子叶前期Ⅲ，幼胚继续发育，其形状近似与棒槌状，并且此时淀粉等物质在胚内开始大量的积累；4、子叶期Ⅰ，苗端开始分化，胚体顶端稍凸起形成苗端，在苗端周围分化产生子叶；5、子叶期Ⅱ，胚的各部分组织分化几乎完成，形态已接近成熟胚，较上一阶段相比其胚胎长度增加明显。

1、多胚现象；2、子叶前期Ⅰ；3、子叶前期Ⅱ；4、子叶前期Ⅲ；5、子叶期Ⅰ；6、子叶期Ⅱ。

观察结果(表1)表明，日5、日12×兴9两个落叶松家系的合子胚发育模式并不相同。在对日5家系落叶松胚胎发育过程进行的观察中发现，6月24日时，该家系胚胎多为多重胚，并且此时的胚多处于子叶前期Ⅱ，而少数则处于子叶前期Ⅰ及Ⅲ阶段；7月1日时，其胚胎多处于子叶前期Ⅲ，少数处于Ⅱ阶段，而未观察到多胚现象，也未发现有胚胎处于子叶前期Ⅰ；7月8日的材料中，未成熟胚多处于子叶期Ⅰ；7月15日时，除极少数处于子叶期Ⅰ和子叶前期Ⅲ的胚胎外，绝大多数胚的形态已接近成熟。

相较而言，日12×兴9家系胚胎的发育并不完全同步，7月1日采集的材料中即有形态学上成熟的胚胎出现；而7月15日采集的材料，仍可观察到早期原胚；并且该家系除7月8日采集的材料外，其余3次采集的材料中均观察到多胚现象；同时，4次采集的材料都未观察到处于子叶期Ⅰ的胚。此外，通过对比观察还发现日12×兴9的合子胚较日5而言其形态成熟更早，这可能是由于日5的雌球花进入可授粉期或受精期更早，也可能是由立地条件的差异致使发育基础不一致而引起的。

表1　不同时期采集的2个落叶松家系各发育阶段合子胚的百分率比较　%

注：表中数据为平均值±标准差；同行不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.2种子质量的变化

对不同时期采集的日5、日12×兴9两个家系的10粒种子的质量进行测量，其结果(表2)表明，两个落叶松家系种子的质量均随生长周期的延长而增加，但两者种子质量增加的过程区别明显。

日5落叶松家系种子的质量在6月24至7月8日这14天内增加并不明显，而7月15日与之前采集的种子的质量则表现出明显差异，其质量较7月8日的种子迅速增加了81.45%。日12×兴9落叶松家系种子的质量变化则相对较为连续，在6月24至7月8日这14 d内，该家系种子的质量持续增加，至7月8日时其种子质量与15日采集的日5种子质量并无显著差别，且其质量在7 d后无明显变化，这与镜检结果相吻合。

2.3未成熟胚长度的变化

不同时期采集的日5、日12×兴9两个家系落叶松的未成熟胚长度的变化明显(表2)，其长度均随生长周期增加而增加。其中日5落叶松前3次采集的未成熟胚长度增加较缓，而在7月8日至15日的一周内其长度迅速增长至成熟胚长度。日12×兴9前3次采集的未成熟胚的长度均高于日5，且7月8日时该家系胚胎就已接近成熟胚的长度。这与种子质量的变化趋势相似，也与二者间散粉期的差异及胚胎发育的镜检结果相一致。

表2　不同时期采集的2个落叶松家系的种子质量、多胚率及胚胎长度变化比较

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.4多胚现象的发生

种子植物通常只有一个胚，而在胚珠中含有两个或两个以上胚的现象被称为多胚现象。因为大多数裸子植物的卵细胞含有2个以上可同时受精的颈卵器，也有部分松柏类植株的胚珠内会同时存在几个可受精的卵细胞，故多胚现象在裸子植物胚胎发育过程中是普遍存在的。但这些多胚由于在胚胎发育的过程中彼此间竞争生长所需的营养物质，所以大部分的胚胎会败育或被吸收，最后仅有1个幼胚能够正常分化并发育至成熟，很少有2个或更多的胚胎能够同时发育成熟。

本研究中，我们发现落叶松胚胎发育的过程中也存在多胚现象，其多胚一般为“一大一小”或“一大几小”形式存在，且很少有发育程度相似的胚胎成对或同时出现。测量发生多胚现象的胚胎长度为130.15～673.62 μm，平均长度为(341.49±144.91)μm。进一步对多胚间胚长的极差进行分析，其最小极差为5.99 μm，最大为420.46 μm，平均为(183.74±117.40)μm。

不同落叶松家系能够观测到多胚现象发生的时间不同(表2)，对日5落叶松而言多胚现象集中发生在7月24日采集的材料中，其发生率高达69.67%；而对于日12×兴9，发生多胚现象的时间范围更广泛，分析表明其多胚率虽然随采集时间延后而在25%～12.5%之间略微降低，但不同采集时间对其多胚率影响并不显著(p=0.621)。结合镜检结果，分析造成二者间这种差异的原因可能是由于杂种落叶松胚胎发育不同步造成的。

2.5胚性愈伤组织的诱导

对接种的外植体进行观察，发现不同时间采集的外植体在诱导胚性愈伤组织的过程中所诱导出的愈伤组织在形态上是不同的。

6月24日及7月1日采集的材料多处于子叶前期，接种时未将胚与胚乳分离。接种后4周内多数外植体无明显变化，仅少数外植体的胚乳会形成一端凸起、质地较硬的白色愈伤或膨大的黄色愈伤，这种黄色愈伤在随后的培养中会迅速褐化。接种6周左右部分外植体的胚乳切口处会有无色透明、似晶体且表面有丝状凸起物的愈伤伸出，这种愈伤组织通过镜检可以观察到ESM结构，说明该种愈伤有继续分化形成体胚的潜在能力，故为胚性愈伤组织。

7月8日及15日采集的胚发育相对成熟，接种时胚与胚乳是相对分离的。接种后7 d左右，部分外植体即有变化发生，其胚胎顶端有白色、米黄色或浅绿色、表面松软而内部质地较硬的愈伤组织形成，镜检发现这种愈伤细胞排列松散且无胚性细胞存在，是典型的非胚性愈伤组织。伴随顶部的变化，部分胚的下胚轴也会形成一种透明或白色半透明、极难分离的愈伤组织，这种愈伤组织在镜检的几个样品中仅发现含有排列整齐的类似胚柄细胞的细胞团，而并未发现有胚性细胞存在，并且这种愈伤在连续的继代中会逐渐褐化死亡或转变成白色不透明的愈伤，根据该愈伤形成的位置，推测其可能是由于下胚轴内部细胞在外源激素的刺激下快速生长而突破表层细胞束缚而形成的细胞团结构，是一种非胚性愈伤组织。

本次试验的13个家系中，共有6个家获得了胚性愈伤组织(表3)，但其诱导率均较低，其中7月1日采集的日5×长77-1未成熟胚的胚性愈伤诱导率最高，达到13.93%。

未成熟胚的胚性愈伤诱导率与取材时间相关，能够诱导出胚性愈伤的未成熟胚主要是在7月1日及以前采集的。运用PASW Statistics 18软件对采集时间与13个落叶松家系胚性愈伤诱导率进行相关性分析。结果表明，不同采集时间的未成熟胚其胚性愈伤诱导率在0.01水平差异显著(p=0)，并且胚性愈伤的诱导率与取材时间呈负相关，即材料的采集时间越晚胚性愈伤组织的诱导率就越低。

对相同时间取材的6个落叶松家系的胚性愈伤诱导率进行比较(表3)发现，不同家系未成熟胚的胚性愈伤的诱导率除7月8日外均表现出差异。6月24日的材料中，有4个家系诱导出胚性愈伤组织，其诱导率日5×兴9>日5×长77-1>日5>长73-44；7月1日有3个家系诱导出胚性愈伤，诱导率日5×长77-1>日5×兴9>日5；7月8日未有家系诱导出胚性愈伤；而7月15日仅有日12×兴9形成胚性愈伤。

1.胚性愈伤组织；2.非胚性愈伤组织；3.EMS结构；4.非胚性细胞。

表3不同采集时间对落叶松胚性愈伤组织诱导率的影响

%

注：同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.6形态学变化与胚性愈伤诱导率的相关性

对不同时间采集的日5、日12×兴9两个家系落叶松材料的形态学特征，即种子质量、胚胎长度及多重胚率与胚性愈伤诱导率之间进行相关性分析(表4)。结果表明：1、胚胎长度和种子质量与其散粉后发育的时间呈现出极显著(p=0.008)和显著(p=0.023)的正相关，且胚胎的长度与种子质量呈极显著正相关(p=0.001)；2、多重胚发生的概率与其散粉后发育的天数、长度及种子质量呈负相关；3、胚性愈伤组织的诱导率与散粉后天数及胚胎长度呈负相关，而与多胚发生率呈显著的正相关(p=0.028)。

表4不同发育天数的种子形态特征及胚性愈伤诱导率间的相关性

相关性多重胚率种子质量胚胎长度散粉后发育天数种子质量-0.370胚胎长度-0.5310.927**散粉后发育天数-0.0880.777*0.845**胚性愈伤诱导率0.761*0.142-0.078-0.085

注：表中** 表示在0.01水平上差异显著；*表示在0.05水平上差异显著。

3结论与讨论

在先前对落叶松胚性愈伤组织诱导的研究中，前人针对不同的问题分别进行了深入研究。其中，齐力旺等[3]对华北落叶松未成熟胚的胚性愈伤诱导与2,4-D、BA、KT质量浓度的关系进行分析；韩登媛等[2]则对影响华北落叶松成熟胚的胚性愈伤组织诱导因素进行研究；而李旦等[15]则以华北落叶松及日本落叶松为材料对球果的各种特征和胚性愈伤组织诱导率的关系进行了分析。

本研究以13个家系不同时间采集的未成熟胚作为材料进行胚性愈伤的诱导，其中长73-44、日5、日5*、日5×长77-1、日5×兴9、日12×兴9等6个家系诱导出了胚性愈伤组织。落叶松胚性愈伤组织的诱导存在种间差异，本试验中供试的3种落叶松，即日本落叶松(日5)、长白落叶松(长73-44)、兴安落叶松(兴12、兴5×兴9)在相同条件下的诱导率分别为5.63%,5.34%及0%。不同家系间胚性愈伤组织的诱导率也存在差异，日5×长77-1家系的胚性愈伤诱导率可达13.93%，而在相同条件下日5×长77-3 CA-1等几个家系的杂种落叶松却未获得胚性愈伤组织。这与王伟达等[1]在对5个杂种落叶松家系进行胚性愈伤的诱导中发现不同家系的杂种落叶松诱导胚性愈伤组织的能力并不相同的结论相一致。此外，未成熟胚个体的基因型也是影响胚性愈伤组织导的因素，日5和日5*是同一立地条件下相同无性系的不同单株，但其自由授粉形成的胚胎在相同的培养条件下诱导率并不相同。通常认为，造成诱导率的差异除遗传因素的影响外还有培养条件的影响，如相同基因型个体在不同培养基条件下的差异。综上所述，在特定的培养条件下，对诱导材料种质(基因型)的选择会影响胚性愈伤诱导的结果。

齐力旺[16]认为华北落叶松合子胚愈伤组织的发生能力与发育时期、状态有关。本研究也得到了相似结果，即的不同采集时间的合子胚发育状况不同，诱导产生的愈伤组织形态也不尽相同。胚性愈伤的诱导率也与取材时间相关，Klimaszewska[5]认为落叶松受精后2～3周的未成熟合子胚最适宜用于胚性愈伤组织诱导。在对其他针叶树的研究中[17-18]，也发现胚性愈伤的诱导存在窗口期，并与胚的发育阶段相关。本研究中未成熟胚的最佳取材时间各落叶松家系间不同，但获得胚性愈伤的未成熟胚材料主要是在7月1日及以前采集的。同时，对日5、日12×兴9两个家系未成熟胚的形态学指标与胚性愈伤诱导率之间的相关性分析表明，胚性愈伤组织的诱导率与散粉天数及胚胎长度呈负相关，而与多胚发生率呈现显著正相关。此外，在本研究中还观察到原胚团的表面存在大量的裂生多胚。因此推测，落叶松胚性愈伤组织的形成可能与多胚现象(特别是裂生多胚)之间存在一定关联，其诱导率可能受诱导材料发育状态的影响。而在实际操作过程中如以易发生多胚现象的家系为材料，或者选择发育程度较低、多胚尚处于共存时期(即处于裂生多胚期)的未成熟胚进行诱导可能更易获得胚性愈伤组织。

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收稿日期：2015年10月16日。

作者简介：第一宋跃，男，1991年6月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail：songyuenefu@163.com。通信作者：李淑娟，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),高级工程师。E-mail：lishujuan@126.com。

1)国家“863”计划项目(2013AA102704-04-03);东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室创新项目(2015B03)。

责任编辑：潘华。