杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的研究*

张海峰

（黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨　150081）



杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的研究*

张海峰

（黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081）

摘要：以杂种落叶松兴7×日77-2、日12×兴9、日3×兴9、日3×兴2、日5×兴9未成熟合子胚为外植体，初步建立杂种落叶松胚性愈伤组织诱导体系。结果表明：不同杂种落叶松在不同培养基和蔗糖浓度下的诱导情况不尽相同，基本培养基中MSG与MS培养基的诱导效果比较好，激素浓度的差异对杂种落叶松也有影响，2,4-D浓度为2.0 mg/L时，诱导率高，蔗糖浓度为30 g/L能诱导出胚性愈伤组织，高浓度的蔗糖反而抑制了胚性愈伤的形成。ABA分别为0、5、10、20、30 mg/L的5个处理中，除对照及ABA30 mg/L时没有诱导出体细胞胚，其他试验组均有一定数量的体细胞胚，但诱导率较低。几种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导最适合的采样时间是7月中旬。

关键词：杂种落叶松；体细胞胚胎发生；愈伤组织；组织培养

*黑龙江省自然科学基金项目（C200801）资助

落叶松（Larix gmellini）为落叶乔木，其树高达35 m，且材质坚硬、耐腐朽[1]，是我国北方一个优良的速生针叶树种，也是主要乡土树种，其造林面积占东北人工林一半以上[2]。落叶松种间杂交具有明显的杂种优势，不同地区最适合的杂交组合不同，不同组合的杂种优势也不同。目前，黑龙江省已选育出一批能适应一定环境、抗逆性强，且速生丰产的优良落叶松杂种家系[3-6]。但由于落叶松存在生长周期长、有性繁殖后代变异大、扦插生根率低等问题，致使其优良性状难以维系。体细胞胚发生具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点，是植物大规模无性繁殖的一种主要手段。目前，国内外对落叶松及不同组合杂种落叶松已经建立了较稳定的体细胞胚发生体系[7-9]。为此，本研究利用体细胞胚胎发生技术，对杂种落叶松胚性愈伤组织进行诱导，以期为建立高效、稳定的杂种落叶松体细胞胚胎发生体系提供技术参考。

1　试验材料与方法

1.1试验材料

2011年7月中旬、7月末、8月初，在牡丹江市林口县青山林场杂种落叶松种子园采集杂种落叶松兴7×日77-2、日12×兴9、日3×兴9、日3×兴2、日5×兴9的未成熟种子，取其合子胚作为外植体进行愈伤组织诱导试验。限于篇幅，本文部分内容仅以具有代表性的日3×兴9的研究结果进行统计分析。

1.2试验方法

1.2.1外植体类型对愈伤组织的诱导

将日3×兴9完整胚（带胚乳）、胚轴、子叶3种外植体类型接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，观察不同外植体类型对胚性愈伤组织诱导的影响。

1.2.2不同培养基及蔗糖、BA、2,4-D浓度对5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

采用L9(34 )正交设计研究基本培养基种类及不同蔗糖、BA、2,4-D浓度对兴7×日77-2、日12×兴9、日3×兴9、日3×兴2、日5×兴9胚性愈伤组织诱导的影响，共9个处理，每个处理重复3次。诱导方法是将接种后的培养基置于暗中培养，培养温度为25℃，每隔30天转移继代1次。

1.2.3发育时期对5种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

取去掉胚乳的合子胚作为外植体，接种在MS+BA0.05 mg/L+2,4D2.0 mg/L+KT0.05 mg/L培养基上，采用单因素完全随机试验设计，研究了种胚发育时期对兴7×日77-2、日12×兴9、日3×兴9、日3×兴2、日5×兴9胚性愈伤组织诱导的影响。本试验共选择了3个不同取材时期，每个取材时期重复3次。

表1　基本培养基种类、蔗糖、BA及2,4-D浓度组合

1.2.4胚性愈伤组织的增殖

以日3×兴9外植体为研究对象，在诱导培养基上发生胚性愈伤组织后，将其转入分别添加浓度为0、0.2、0.1 mg/L 2，4-D的培养基上进行培养，每个处理重复3次，继代培养两次后，对胚性愈伤组织的增长量进行记录和统计分析。

1.2.5体细胞胚的形成

将诱导、增殖所得到的将要分化的胚性愈伤组织转接到以MS培养基为基本培养基，并分别添加ABA 0、5、10、15、20、30 mg/L的培养基中，同时附加蔗糖30 g/L，其余条件不变。

1.2.6数据处理与统计分析

通过统计愈伤组织、体细胞胚的个数，计算出愈伤组织及体细胞胚产生的百分数。

体胚发生率=产生愈伤的幼胚数量/接种培养的所有幼胚数量×100%

胚性愈伤诱导率=产生愈伤的幼胚数量/接种培养的所有幼胚数量×100%

试验获得的愈伤组织使用解剖镜记录、拍照，培养30天后，统计胚性愈伤组织的诱导率，采用Excel 2007和SPSS19.0软件处理数据，最后进行方差分析与多重比较。

2　结果与分析

2.1杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的研究

2.1.1外植体类型对日3×兴9杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

在供试的3个外植体类型中，以完整胚（带胚乳）、胚轴为外植体的供试材料诱导出了胚性愈伤组织（图1，图2），其中以完整胚（带胚乳）为外植体时，诱导率最高（13.3%）。以分离的子叶和胚轴为外植体时，仅胚轴有胚性愈伤组织出现，但诱导率很低（6.6%）；而以子叶为外植体时，没有愈伤组织发生（表2）。

图1　胚轴处产生胚性愈伤

图2　胚性愈伤团

表2　外植体类型对日3×兴9杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

2.1.2培养环境对胚性愈伤组织诱导的影响

以日3×兴9未成熟合子胚为外植体，在培养基上进行了不同光暗处理对杂种落叶松愈伤组织诱导影响的研究，8周后的调查结果（表3）表明，光照条件（C）培养下，外植体部分形成绿色致密的愈伤组织，有部分外植体褐化，在少数绿色致密愈伤组织中有不定芽出现。先黑暗培养30天后再移到光照下的处理（B），在黑暗情况下有胚性愈伤团形成（图3），但转移到光下后，胚性愈伤组织全部变成褐色、致密的愈伤组织（图4），没有进一步分化、增殖。经过2个月的暗培养（A），外植体产生胚性愈伤组织的诱导率达9.2%，且能进一步保持。这说明，各种植物愈伤组织对光照条件要求不同，杂种落叶松体胚的诱导条件和愈伤组织一样都需要在黑暗条件下启动，光照反而会抑制胚性愈伤组织的形成和进一步发育。

表3　培养环境对杂种落叶松愈伤组织诱导的影响

图3　胚性愈伤图

图4　褐色愈伤组织

2.1.3不同培养基及蔗糖、BA、2,4-D浓度对5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

由表4可以看出，不同杂种落叶松在不同培养基和蔗糖浓度下的诱导效果不尽相同，其中MSG与MS培养基的诱导效果比较好；激素浓度的差异对杂种落叶松的诱导效果也有影响，2,4-D浓度为2.0 mg/L时诱导率高；蔗糖浓度为30 g/L时，能诱导出胚性愈伤组织，高浓度的蔗糖反而抑制了胚性愈伤的形成。在日本落叶松与兴安落叶松杂交品种中，选择MSG或MS培养基，同时附加BA0.5 mg/L+2,4-D2.0 mg/L效果较好，可作为进一步研究的基础。

表4　不同培养基和蔗糖、BA、2,4-D浓度对5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

2.1.4发育时期对5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

试验结果（表5）表明，不同发育时期对5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导的影响不同，胚性愈伤组织诱导最适宜的采样时间是7月中旬，但此时仅能保持发生率在10%左右，且诱导率较低。而7月末和8月初接种的仅有少量胚性愈伤组织出现，绝大部分出现大量褐色、红色的非胚性致密的愈伤组织。这说明在诱导胚性愈伤组织时，外植体材料以幼嫩为宜，因为此时其内含物质正处于最旺盛的时期。

2.2胚性愈伤组织的增殖与体细胞胚的形成

2.2.1激素浓度对胚性愈伤组织增殖的影响

试验结果（图5）表明，随着激素浓度的下降，增殖数量增加，但增殖率非常低，而且褐化情况也有所降低。经方差分析，差异不明显（P＞0.05）。

表5　不同发育时期幼胚的愈伤组织发生率　%

图5　激素浓度对胚性愈伤组织增殖量和褐化率的影响

2.2.2体细胞胚的形成

胚性愈伤组织增殖培养1、2次后，接入体细胞胚诱导培养基中，试验结果（图6）表明，除对照及ABA30 mg/L时，仅有一些畸形胚出现，以及部分提前萌发外，其他试验组均有一定数量的体细胞胚，诱导率较低。这说明落叶松诱导体细胞胚发生时需要一定浓度的ABA催化。

图6　 ABA浓度对体细胞胚发生的影响

3　结　论

5种杂种落叶松胚性愈伤组织诱导最适合的采样时间是7月中旬。在日本落叶松与兴安落叶松杂交品种中，选择MSG或MS培养基，同时附加BA0.5 mg/L+2,4-D2.0 mg/L时，诱导率高，可作为进一步研究的基础。蔗糖浓度为30 mg/L时，能诱导出胚性愈伤组织，高浓度的蔗糖反而抑制了胚性愈伤的形成。

参考文献

［1］周以良.黑龙江树木志［M］.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1986.

［2］潘立本,张含国,周显昌.杂种落叶松的增产能力及其生产应用前景［J］.林业科技开发,1998（2）:18-20.

［3］张含国,张成林,兰士波,等.落叶松杂种优势分析及家系选择［J］.南京林业大学学报(自然科学版),2005,29（3）:69-72.

［4］李艳霞,李若林,周显昌,等.杂种落叶松优良家系及优良单株的选择［J］.林业科技,2009,34（1）:5-7.

［5］翁海龙，王福德，王鑫，等.杂种落叶松继代嫁接幼化技术研究初报［J］.林业科技，2015,40（1）:22-23.

［6］杨柏林，贾庆彬，张含国，等.杂种落叶松优良家系选择研究［J］.林业科技，2014,39（2）:1-4.

［7］齐力旺,韩一凡,李玲.华北落叶松体细胞胚发生及植株再生实验系统的建立［J］.实验生物学报,2000,33（4）:357 -365.

［8］吕守芳,张守攻,齐力旺,等.日本落叶松体细胞胚胎发生的研究［J］.林业科学,2015,41（2）:48-53.

［9］于祎，赵彤彤，杨巍，等.红松成熟合子胚愈伤组织诱导的适宜培育条件［J］.森林工程，2015,31（2）:5-7.

（责任编辑：王岳）

Study on the Induction of Embryogenic Callus of Hybrid Larchs

ZHANGHaifeng
（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150081）

Abstract By the immature zygotic embryos of Larix gmelinii 7×L.kaempferi 77-2,L.kaempferi 12× L.gmelinii 9,L.kaempferi 3×L.gmelinii 9,L.kaempferi 3×L.gmelinii 2,L.kaempferi 5×L.gmelinii 9 as explants,hybrid Larch embryogenic callus induction system was preliminarily established.The results showed that different hybrid larch in different culture medium and sucrose concentration are not the same,basic culture medium MSG and MS for inducing effect better,differences in hormone concentrations for Larch had also been affected,the concentration of 2,4-D at 2.0 induction rate high,sucrose concentration at 30 induce embryogenic callus,high concentration sucrose inhibited the embryonic callus formation.ABA were 0,5,10,20,30 mg/L 5 treatment,except the control and ABA 30mg/L did not induce somatic embryos,there was a certain number of somatic embryos and induction frequency is low in other groups.The most suitable sampling time of several hybrid larch embryogenic callus induction was in the middle of July.

Key words Hybridlarchs;Somatic embryogenesis;Callus;Tissue culture

收稿日期：2016-01-05

作者简介：第1张海峰（1975-），男，高级工程师，硕士学位，主要从事经济林、林木遗传育种方向研究。

文章编号：1001-9499（2016）02-0009-04

中图分类号：S791.22,S722.3+7

文献标识码：A