长期注射成纤维细胞生长因子21对二乙基亚硝胺诱发肝癌的预防作用

李德山，张瑛杰，徐鹏飞，袁清艳，任桂萍，刘铭瑶，刘芝航（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨　150030）



长期注射成纤维细胞生长因子21对二乙基亚硝胺诱发肝癌的预防作用

李德山，张瑛杰，徐鹏飞，袁清艳，任桂萍，刘铭瑶，刘芝航
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

摘要：研究成纤维细胞生长因子21（FGF21）对二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝癌模型的预防作用及机制。健康雄性wistar大鼠随机分3组：FGF21组，模型对照组及正常对照组。FGF21组大鼠每天注射一次FGF21，注射20周。2周后，FGF21组大鼠和模型组大鼠同时每3 d注射一次DEN，直至试验结束。给药结束后，取各组大鼠血清样本测定肝功，统计各组大鼠肝癌发生率，比较各组大鼠肝脏内氧化应激水平。结果表明，FGF21治疗组肝功显著低于模型对照组，接近正常水平。通过分析各组大鼠肝脏变化发现，FGF21治疗组大鼠肝癌发生率为18.1%，而注射生理盐水的模型对照组肝癌发生率为60.0%。FGF21治疗组肝脏内的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量显著低于模型对照组，接近正常对照组；FGF21治疗组肝脏内超氧化物歧化酶（SOD）活性与正常对照组持平，显著高于模型对照组。Real-time PCR结果显示，FGF21治疗组肝脏的抗氧化酶基因（G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2）表达水平显著高于模型对照组。结果表明，长期注射FGF21可通过抑制肝脏内氧化应激水平预防DEN诱导的肝癌。

关键词：成纤维细胞生长因子21；二乙基亚硝胺；肝癌；氧化应激

李德山,张瑛杰,徐鹏飞,等.长期注射成纤维细胞生长因子21对二乙基亚硝胺诱发肝癌的预防作用[J].东北农业大学学报,2016,47(3):17-22.

Li Deshan,Zhang Yingjie,Xu Pengfei,et al.Long-term administration of fibroblast growth factor 21 prevents DEN-induced hepatocarcinogenesis[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):17-22.(in Chinese with English abstract)

糖尿病是由多种病因引起的代谢类疾病，发展过程损害肝脏、心脏、血管、眼睛、肾脏和神经等组织和器官[1]。研究发现，糖尿病和肝癌具有相关性：一方面，糖尿病是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）发病因素，非酒精性脂肪肝病可导致肝癌；另一方面，末期肝病可引起葡萄糖耐受和糖尿病[2-7]。此外，临床统计发现糖尿病患者肝癌发病率比正常人高2～3倍[8]。因此，糖尿病临床治疗需兼顾治疗糖尿病且预防肝癌的新型药物。

成纤维细胞生长因子21（FGF21）属于FGF家族中FGF19亚家族成员之一[9]，是最近发现具有调节内分泌功能的细胞因子，主要表达于肝脏，具有独立、安全及有效调节生物体内血糖水平的能力[10-12]，可成为糖尿病患者的理想降糖药物。Huang等发现大鼠肝脏内高表达FGF21可预防DEN诱导的肝癌发生[13]。推测长期注射FGF21也能预防肝癌。本文利用DEN诱导大鼠肝癌模型，同时注射FGF21，发现长期注射FGF21可预防肝癌。为FGF21临床应用治疗糖尿病提供新参考。

1　材料与方法

1.1材料

40只健康、雄性wistar大鼠（体重200～250 g）购自长春亿斯公司（动物合格证号：SCXK 2011-0004）；二乙基亚硝胺购于TCI公司；活性氧（ROS）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒和总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒购于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天；鼠源FGF21（mFGF21）由东北农业大学生命中心生物制药实验室构建表达纯化[14-15]。

1.2实时荧光定量PCR引物

GAPDH上游引物为5' TTCACCACCATGGAGA AGGC 3'，下游引物为5' GGCATGGACTGTGGTCAT GA 3'。AFP上游引物为5' ACCATCGAGCTCGGCT ATTG 3'，下游引物为5' GAGACAGGAAGGTTGGG GTG 3'。GCL-c上游引物为5' TGTGAATCCAGGGC AGCCTA 3'，下游引物为5'ATCCTCAGTTCCTGCA CAT 3'；Gpx-1上游引物为5' AGGAGAATGGCAAG AATGAAGA 3'，下游引物为5' AGGAAGGTAAAGA GCGGGTGA 3'；Sod2上游引物为5' GTTTGCAAGA AGTGAAGC 3'，下游引物为5' ACTACAAAACACC CACCA 3'；G6pdh上游引物为5' TTCCGGGATGGC CTTCTAC 3'，下游引物为5' TTTGCGGATGTCATC CACTGT 3'。

1.3 DEN诱导肝癌模型的复制

wistar大鼠随机分为3组：FGF21组（n=15），模型对照组（n=15）及正常对照组（n=10）。FGF21组大鼠每天注射一次FGF21（3 mg·kg-1），注射20周。2周后，FGF21组大鼠和模型组大鼠同时每3 d注射一次DEN（10 μg·g-1），直至试验结束。

1.4肝癌发生率及肝肿瘤数量统计

给药结束后，分别取各组大鼠肝脏，观察统计各组大鼠肝癌发病率，并计算癌变肝脏肿瘤数目。

1.5肝功及肝脏α-甲胎蛋白（AFP）mRNA表达水平测量

给药结束后，分别取各组大鼠血清，于哈尔滨电力医院测量血清中ALP、ALT、AST、GGT，Trizol法提取肝脏总RNA。以不同处理的肝脏总RNA为模板，Oligo（dT）18为引物反转录合成cDNA。选用在肝脏组织中稳定表达的β-actin作为内参，利用real-time PCR测定各组肝脏内AFP mRNA表达水平。

1.6肝脏内活性氧（ROS）检测

在温和条件下PBS中分离各组新鲜肝脏组织中肝细胞，将分离的肝细胞接种至6孔板中，并对每组肝细胞计数，使每个孔内细胞数量达1× 106。然后分别向各组细胞中加入DCFH-DA（10 μmol·L-1），37℃细胞培养箱内孵育30 min，PBS洗涤细胞3次后，荧光显微镜及流式细胞仪检测。

1.7肝脏中丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）水平检测

利用玻璃匀浆器对新鲜肝脏组织匀浆，按照超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒说明书测量肝脏内MDA和总SOD水平。

1.8肝脏内抗氧化酶（G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2）mRNA水平测定

利用Trizol法提取肝脏总RNA。以不同处理肝脏总RNA为模板，Oligo（dT）18为引物反转录合成cDNA。选用在肝脏组织中稳定表达的β-actin作为内参，利用real-time PCR测定各组肝脏内G6pdh,GCL-c，Gpx-1，Sod2 mRNA表达水平。

1.9统计学分析

各组数据均采用SPSS 15.0统计分析,进行单因素方差分析及两两比较。

2　结果与分析

2.1 FGF21对DEN诱导肝癌发生影响

给药过程中，FGF21组（FGF21）大鼠死亡4只（剩余11只），模型对照组（Saline）大鼠死亡5只（剩余10只），正常对照组（Normal）大鼠未出现死亡。通过统计各组大鼠肝脏癌变情况及癌变肝脏表面肿瘤数目，发现FGF21治疗组仅2只大鼠肝脏出现肿瘤（肝癌发生率为18.1%），而模型对照组有6只大鼠（肝癌发生率为60%），且模型对照组大鼠发生癌变的肝脏上肿瘤数目显著多于FGF21治疗组（见图1）。结果表明，长期注射FGF21可预防DEN诱导肝癌发生。

2.2 FGF21对DEN诱导肝癌大鼠肝功影响

模型对照组（Saline）与正常对照组（Normal）相比，血清中ALP、ALT、AST、GGT水平显著升高；FGF21治疗组（FGF21）与模型对照组相比，血清中ALP、ALT、AST、GGT水平显著下降（见表1）。

图1　长期注射FGF21抑制肝癌发生，*P<0.05Fig.1 FGF21 prevents DEN-induced hepatocarcinogenesis in rats,* P<0.05

表1　血清肝功能四项Table 1　 Liver function parameters in sera of the experimental rats　(IU·L-1)

2.3 FGF21对DEN诱导肝癌大鼠肝脏内-甲胎蛋白（AFP）mRNA表达水平影响

AFP是肝癌的特异性标志，Real-time PCR结果显示，模型对照组（Saline）大鼠肝脏内AFP mRNA表达水平显著高于正常组（Normal）；而FGF21治疗组（FGF21）大鼠肝脏内AFP mRNA表达水平显著低于模型对照组，与正常组接近。结果表明FGF21组大鼠肝脏癌变情况显著低于模型对照组（见图2）。

2.4 FGF21对DEN诱导肝癌大鼠肝脏内ROS含量影响

流式细胞仪和荧光显微镜检测结果发现，模型对照组（Saline）大鼠肝脏内ROS含量显著高于正常对照组（Normal）[流式结果显示：模型对照vs正常对照组为76.1% vs 56.0%]，而FGF21给药组大鼠肝脏内ROS含量显著低于模型对照组[流式结果显示：FGF21组vs模型对照组为76.1% vs 66.4%]（见图3）。结果表明，FGF21可抑制肝脏内DEN引起的氧化应激。

图2　长期注射FGF21后肝脏中AFP表达量变化Fig.2 Effect of FGF21 on changes of AFP afterlong-term administration

图3　长期注射FGF21后肝脏中ROS含量变化Fig.3 Effect of FGF21 on ROS in liver cells

2.5 FGF21对DEN诱导肝癌大鼠肝脏内MDA和总SOD水平影响

与正常对照组（Normal）相比，模型组大鼠肝脏内MDA含量显著升高，总SOD活力显著下降。而FGF21给药组（FGF21）与模型对照组（Saline）相比，MDA含量显著下降，总SOD活力显著升高，接近正常水平（见图4、5）。由图4、5可知，FGF21可通过抑制MDA产生且提高总SOD活力抑制氧化应激。

2.6 FGF21对DEN诱导肝癌大鼠肝脏抗氧化基因mRNA表达水平影响

抗氧化酶基因（G6pdh，GCL- c，Gpx- 1，Sod2）在机体抗氧化过程中发挥重要作用，增加它们表达量可以增加细胞对氧化应激的抗性，进而保护组织器官。Real-time PCR结果显示模型对照组（Saline）大鼠肝脏内G6pdh，GCL- c，Gpx-1，Sod2 mRNA表达水平显著低于正常对照组（Normal），而FGF21治疗组（FGF21）肝脏内G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2）mRNA表达水平显著高于模型对照组，其中GCL-c的mRNA表达水平与正常组之间无差异显著性（见图6）。结果表明，FGF21可以通过促进抗氧化酶基因表达来抑制氧化应激。

图4　长期注射FGF21后肝脏中MDA含量Fig.4 Effect of FGF21 on MDA activity in the livers

图5　长期注射FGF21后肝脏中SOD活性Fig.5 Effect of FGF21 on SOD activity in the livers of three groups

图6　长期注射FGF21后肝脏中G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2表达量影响Fig.6 Effect of FGF21 on mRNA expressions of G6pdh,GCL-c,Gpx-1,Sod2 in the livers

3　讨论与结论

糖尿病是肝癌发生的独立发病因素[8]，因此，预防糖尿病引发肝癌尤为必要。成纤维细胞生长因子21（FGF21）是FGF家族成员，能降低血糖、血脂、减少肝脏和血管的脂肪蓄积等效应[16-18]，有望成为糖尿病治疗新药。研究表明，肝脏高表达FGF21还可以预防DEN诱导的肝癌发生[13]，但体外长期注射FGF21能否预防肝癌发生尚不清楚。本研究利用低剂量DEN诱导肝癌模型，持续长期注射FGF21，探究FGF21能否降低DEN诱导的肝癌发病率，发现FGF21治疗组肝癌发病率为18.1%，模型对照组肝癌发病率为60.0%，且FGF21治疗组大鼠的肝功及AFP表达水平显著低于模型对照组，说明长期注射FGF21能预防肝癌发生。

肝癌产生主要是由于肝脏长期处在氧化应激和炎症环境[19-21]。氧化应激是指机体ROS产生过多或（和）机体抗氧化能力下降，ROS的清除不足，导致活性氧在体内增多并引起细胞氧化损伤（Oxidative damage）的病理过程[22]。FGF21与氧化应激相关，韩苗苗等发现在过氧化氢诱导大鼠心肌细胞H9c2上，FGF21处理可抑制过氧化氢引起的氧化应激[23]，Dewei等发现FGF21可通过上调肝脏内抗氧化基因表达水平抑制APAP引起的肝脏氧化应激[24]。因此，推测长期注射FGF21可通过抑制氧化应激预防肝癌发生，并测定各组大鼠肝脏内氧化应激相关指标验证。ROS是一组化学性质活泼的具有含氧基团化合物，存在多样形式，如超氧根阴离子（O2-）、羟自由基（OH·）、氢氧根离子（OH-）、过氧化氢（H2O2）等，前两者不稳定，而后两者相对稳定，其中自由基是最主要的ROS，机体内ROS含量升高会引起DNA损伤和转化，使细胞发生癌变；丙二醛（MDA）是生物体脂质氧化的天然产物，动物或植物细胞发生氧化应激时，发生脂质氧化。脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂化合物，其中包括MDA。通过检测胞内活性氧含量以及脂质氧化（MDA）程度发现，FGF21给药组大鼠肝脏内ROS 和MDA含量显著低于模型对照组，说明FGF21可通过调控细胞氧化还原系统，减少ROS过量堆积，抑制肿瘤发生。SOD是细胞内清除活性氧的主要酶类；G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2是机体主要抗氧化酶。检测发现，FGF21给药组大鼠肝脏内总SOD活力和G6pdh，GCL-c，Gpx-1，Sod2表达水平显著高于模型对照组，表明体内抗氧化酶防御系统能力恢复并增强，抗氧化能力增强使机体清除自由基能力加强，可成为FGF21抑制氧化应激水平机制之一。

综上所述，长期注射FGF21可预防肝癌发生，减少肝脏内ROS含量，抑制肝脏内氧化应激水平。长期注射FGF21治疗糖尿病可预防由糖尿病引起的肝癌。

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Long-term administration of fibroblast growth factor 21 prevents DEN-induced hepatocarcinogenesis

LI Deshan,ZHANG Yingjie,XU Pengfei,YUAN Qingyan,REN Guiping,LIU Mingyao,LIU Zhihang(School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract:This paper was to evaluate the preventive effect of fibroblast growth factor 21(FGF21)on diethylnitrosamine(DEN)induced hepatocarcinogenesis in rats and to provide mechanistic insights into its preventive effect.Healthy male wistar rats were randomized into 3 groups:FGF21 group,model control and normal control.Rats were administered with FGF21 once daily for 20 weeks.Two weeks later,the rats were simultaneously administered with DEN every three days until the end of the experiment.At the end of the treatment,blood samples were collected,and liver function was measured.Then the tumor incidence in each liver tissue was analyzed.Besides,we also compared the oxidative stress levels of the livers in each group.The results showed that the liver founction of thebook=18,ebook=23model control group was significantly higher than FGF21 treatment group,which was closed to the normal control group.By analyzing the changes in the livers,found that the hepatoma incidence of the rats treated with FGF21 was 18.1%,while the incidence of the rats treated with saline was 60.0%.The treatment also found that the ROS production and MDA content were significantly increased and the activity of the SOD was significantly decreased compared with normal group and FGF21 group,whereas MDA content and the activity of SOD between the normal group and FGF21 group were not statistically difference.The realtime PCR showed that the expression of the antioxidant genes(G6pdh,GCL- c,Gpx-1,Sod2)in model control group was significantly up- regulated compared with normal control group and FGF21 group,whereas expression levels of the antioxidant genes in the FGF21 group were significantly improved compared to the model control group.To summary,long-term administration of FGF21 could prevent DEN-induced hepatocarcinogenesis via suppressing oxidative stress.

Key words:fibroblast growth factor 21; diethylnitrosamine; hepatoma; oxidative stress

作者简介：李德山（1950-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为生物技术制药。E-mail:deshanli@163.com

基金项目：国家自然基金东北农业大学生物学理科基地科研训练及科研能力提高项目（J1210069/J0116）

收稿日期：2015-03-03

中图分类号：R575；Q816

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）03-0017-06