C-8神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性及紧密连接蛋白的影响

汪 影，杨 进，刘 辉，毕继蕊，卫园园，操基玉，陆友金

C-8神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性及紧密连接蛋白的影响

汪 影1，杨 进1，刘 辉1，毕继蕊1，卫园园1，操基玉2，陆友金1

目的研究外源性 C-8神经酰胺对肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）单层通透性的影响，探讨其作用机制。方法将体外分离培养的 AECⅡ通过差速贴壁法纯化，在 Transwell上构建 单层，待细 胞融合后给 予不同 浓度的 C-8神经酰胺（0、25、50、100μmol／L）继续培养 24 h，应用伏欧计测定跨上皮电阻值（TEER）及辣根过氧化物酶（HRP）标记法检测吸光度（OD）值；分别提取细胞总蛋白及总 RNA，采用Western blot和实时定量聚合酶链式反应方 法检测不同浓度的 C-8神经酰胺对 AECⅡ紧密连接蛋白 ZO-1和 Occludin蛋白水平和 mRNA水平表达的影响。结果不同浓度的 C-8神经酰胺刺激融合的 AECⅡ单层 24 h后，各组间 TEER值、OD值 差 异 均 有 统 计 学意 义 （F=38.780、19.780，P＜0.001）。C-8神 经 酰 胺 作 用 后，ZO-1、Occludin蛋 白 （F= 71.150，P＜0.01；F=7.703，P=0.002）及 mRNA（F= 4.887，P=0.014；F=3.637，P=0.048）表达量明显降低。

神经酰胺；紧密连接；肺上皮细胞；跨上皮电阻

急性 呼 吸窘迫综合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）最显著的病理学变化是弥漫性肺泡上皮细胞损伤，包括肺泡上皮屏障、肺泡水清除、肺泡表面活性物质的分泌等［1］。其中肺泡上皮屏障损伤是 ARDS发病环节中的重要一步，而肺泡上皮屏障发挥选择性通透作用主要依赖于肺泡上皮细胞间紧密连接［2］。研究［3］表明，神经酰胺在 ARDS肺水肿发展过程中发挥重要作用，其可抑制肺泡表面活性物质生成而促进肺水肿形成，然而目前有关神经酰胺与肺泡上皮屏障之间关系的研究甚少。研究［4］表明神经酰胺能够增加肠道上皮细胞的通透性。该研究试图在细胞水平上研究 C-8神经酰胺对肺上皮屏障通透性的影响，初步探讨其作用机制，为下一步抑制神经酰胺生成从而治疗ARDS提供理论依据，为 ARDS的诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级 6～8周龄 ICR小鼠 8只，雌雄各半，20～25 g，由安徽省实验动物中心提供。动物房温度维持于 20～25℃，相对湿度（50± 5）%，每日光照时间约 12 h。将实验鼠按雄：雌为 1∶1于 21∶00进行合笼，次日 9∶00查阴栓，阴栓阳性者记为妊娠第1天。

1.1.2试剂及器材 DMEM、胰酶、胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）、PBS均购自美国 Hyclone公司；C-8神经酰胺购自美国 Cayman公司；Transwell小室购自美国 Corning公司；跨上皮电阻仪购自美国 Millipore公司；ZO-1单克隆抗体购自美国 Zymed公司；Occludin多克隆抗体购自美国 Abcam公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国 Promega公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养条件及方法 参照王勇 等［5］方法将第 17天 ICR孕鼠颈椎脱臼法处死，于酒精中浸泡5 min，取出胎鼠后置于预冷 4℃无菌 PBS中，提取双肺并尽量除去气管、支气管、血管等组织，润洗 3遍后用无菌眼科剪于 5 min之内剪成 1 mm3的小块并用 PBS清洗直至液体清亮。0.25%胰蛋白酶消化组织块 10 min，消化期间每隔 5 min震荡 1次，随即加入等体积的含有 10%FBS的 DMEM终止消化，过滤，1000 r／min（离心半径为 156 mm）离心 5 min，弃上清液，加入含10%FBS的 DMEM制成细胞悬液接种于培养皿，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，1 h后换皿，重复 3次。24 h后换液，此时贴壁细胞即为肺泡 Ⅱ 型上皮 细胞（alveolar typeⅡ epithelial cells，AECⅡ）。

1.2.2胎鼠 AECⅡ的鉴定 ① 倒置相差显微镜观察：运用倒置显微镜观察 AECⅡ贴壁生长情况及形态学特征；② 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）染色法鉴定：将对数生长期的 AECⅡ接种到12孔板制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定，按照BCIP／NBT AKP显色试剂盒说明书进行操作；③ 透射电镜鉴定：对数生长期的 AECⅡ经 PBS清洗，胰酶消化后，2 500 r／min（离心半径为 156 mm）离心10 min，2.5%戊二醛固定、包埋，制作超薄切片，于透射电镜下观察。

1.2.3肺上皮细胞单层通透性 ① 跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）的 测 定：AECⅡ以 3×105／cm2接种于 Transwell的顶层小室微孔膜上，根据本课题组前期 MTT实验结果［6］，随机分为 0、25、50、100μmol／L C-8神经酰胺培养 24 h，应用跨上皮电阻测量仪检测各组 TEER。② 辣根过氧化物酶标记法（horseradish peroxidase notation，HRP）：细胞融合后加入终浓度为 0、25、50、100 μmol／LC-8神经酰胺培养 24 h，弃去上室培养液，加入浓度为 0.34 mg／ml HRP的 DMEM，孵育 1 min后，取下室液 60μl，加入 860μl混合反应液（50 mmol／L NaH2PO4和 5 mmol／L愈创木酚）及 100μl新鲜配制的 0.6 mmol／L H2O2溶液，置于 12孔板中，室温反应 15 min后检测波长在 470 nm 下的HRP吸光度（optical density，OD）变化。

1.2.4Western blot法检测紧密连接蛋白的表达给予不 同 浓 度 的 C-8神 经 酰 胺 （0、25、50、100 μmol／L）刺激后消化收集各组细胞，裂解离心（12 000 r／min，离心 10 min）提取蛋白质。二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，再转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭 90 min，TBST漂洗 10 min×3次；分别加入抗 ZO-1鼠单抗（1∶200）、抗 Occludin兔多抗（1∶250）4℃过夜，TBST漂洗 3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶100 000）于摇床室温孵育 75 min，TBST漂洗 10 min×4次，ECL显色。用天能图像分析系统进行分析。

1.2.5实时定量 PCR检测紧密连接 mRNA的表达

提取 RNA，逆转录为 cDNA，并以此为模板进行PCR扩 增。本 实 验 所用 引 物 使用 PubMed在 线Primer3软件设计，由上海生工公司合成，小鼠各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列和基因片段长度

1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0统计软件进行分析，正态性数据以 ¯x±s表示；两组之间的均数比较采用两独立样本 t检验，多组间的均数比较采用方差分析；两两比较采用 LSD检验。

2 结果

2.1 AECⅡ细胞鉴定倒置显微镜下观察到原代培养18～24 h后，AECⅡ贴壁伸展，呈圆形或立方形，胞质内有大量细小颗粒围绕细胞核分布（图1A）；体外培养24 h后进行 AKP染色，细胞内 AKP反应产物呈深蓝色（图1B）；透射电镜下可见 AECⅡ内有特征性的板层小体（箭头所示），于细胞膜上有时可见微绒毛（图1C）。

2.2 C-8神经酰胺对AECⅡ单层细胞通透性的影响随着 C-8神经酰胺浓度的增加，TEER值逐渐下降，各组间 TEER值差异有统计学意义 （F= 38.780，P＜0.001）。不同浓度组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。HRP测定结果显示，随着浓度的增加 OD值呈上升趋势，各组间 OD值差异有统计学意义（F=19.780，P＜0.001），神经酰胺 50μmol／L组和 100μmol／L组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

图1 AECⅡ细胞鉴定图片A：倒置显微镜下可见 AECⅡ呈圆形或立方形 ×200；B：显微镜下可见细胞内的 AKP反应产物呈深蓝色 AKP染色 ×200；C：电镜下可见 AECⅡ内有特征性板层小体 ×15 000

表2 不同浓度 C-8神经酰胺对 AECⅡ单层通透性的影响（n=5，¯x±s）

2.3 C-8神经酰胺对AECⅡ紧密连接蛋白表达的影响采用 Western blot法检测各组 ZO-1和 Occludin蛋白的表达情况（图2），结果显示各组 ZO-1的表达差异有统计学意义（F=71.150，P＜0.001）。C-8神经酰胺各剂量组与对照组相比，ZO-1的表达均显著下调（P＜0.05）。各组 Occludin的表达差异有统计学意义（F=7.703，P=0.002）。神经酰胺50μmol／L组和 100μmol／L组与对照组相比，Occludin的表达均下调（P＜0.05）。

图2 C-8神经酰胺对 AECⅡ紧密连接蛋白表达的影响1：0μmol／L组；2：25μmol／L组；3：50μmol／L组；4：100μmol／L组；A：ZO-1；B：Occludin；与对照组（0μmol／L）比较：*P＜0.05

2.4 C-8神经酰胺对AECⅡ紧密连接mRNA表达的影响C-8神经酰胺作用后，ZO-1及 Occludin mRNA表达水平均有所下调（ZO-1：F=4.887，P= 0.014；Occludin：F=3.637，P=0.048），与对照组相比，C-8神经酰胺 100μmol／L组差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 C-8神经酰胺对 AECⅡ紧密连接 mRNA表达的影响A：ZO-1；B：Occludin；与对照组（0μmol／L）比较：*P＜0.05

3 讨论

ARDS是临床高病死率疾病，目前尚缺乏有效的诊 断 及 治 疗 手 段［7］。 既 往 研 究［8-9］显 示，在ARDS发生过程中，紧密连接蛋白表达和分布发生改变，对液体和蛋白质经细胞旁途径选择性通透作用增强而导致肺水肿。当机体遭受应激刺激时，神经酰胺可作为“第二信号分子”发挥信号传导作用，放大炎症反应引起组织损伤［10］。前期研究［6］已验证神经酰胺可引起肺泡细胞损伤，本研究显示在神经酰胺刺激下 TEER显著下降，OD值呈上升趋势，即神经酰胺导致肺泡上皮通透性增加，且这种变化具有一定的浓度依赖性。在哺乳动物体内，多种神经酰胺合酶可催化合成不同长度酰基链的神经酰胺。研究［11］表明 C-8神经酰胺水溶性较好，细胞膜穿透力较强，对细胞的增殖分化具有更明显的影响，故本实验使用 C-8神经酰胺作为研究对象。

在 ARDS动物模型中神经酰胺增加［12］，通过抑制神经酰胺表达可以减轻肺水肿、炎症反应，改善小鼠生存率［13］。同时神经酰胺参与肠上皮屏障及皮肤上皮屏障功能的调节［4］，本研究表明神经酰胺通过降低紧密连接蛋白的表达增加肺泡上皮细胞的通透性。本研究中4组间 AECⅡ各紧密连接表达量有明显差异，Western blot显示随着神经酰胺剂量的增加，ZO-1及 Occludin表达逐渐减弱；应 用 Realtime PCR检测到给予 100μmol／L神经酰胺刺激后AECⅡ表达 ZO-1、Occludin mRNA明显降低。上述结果提示 C-8神经酰胺可能通过紧密连接影响肺上皮通透性，同时也可表明神经酰胺对紧密连接 ZO-1和 Occludin的调节主要发生在蛋白水平，加大剂量才发生转录水平的变化，这可能与神经酰胺导致的损伤是个急性损伤有关，具体机制仍有待研究。

综上所述，本研究显示 C-8神经酰胺能够增加AECⅡ单层细胞的通透性，下调紧密连接蛋白的表达，这些蛋白可能是神经酰胺增加肺上皮屏障通透性的作用靶点，为进一步研究神经酰胺引起肺上皮屏障功能受损的分子机制提供了基础，同时为 ALI提供新的诊断思路及治疗靶点。

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Effects of C-8 ceram ide on themonolayer permeability and the tight junction proteins in alveolar epithelial typeⅡ cells

Wang Ying，Yang Jin，Liu Hui，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To study the impactof C-8 ceramide on the alveolar epithelial barrier and the tight junction proteins of alveolar epithelial typeⅡ cells（AECⅡ）.Methods The primarily cultured AECⅡ was purified by differential adherencemethod.The cellswere seeded on Transwell polyestermembranes to construct in vitro models of AECⅡ monolayerswith different concentrations of C-8 ceramide（0，25，50，100μmol／L）for24 hourswhen they became fused.Themonolayer permeability wasmeasured by transepithelial electrical resistance（TEER）and horseradish peroxidase notation（HRP）.The total protein and RNA were extracted from AECⅡ.Western blot and real-time quantitative pclymerase chain reaction were used to detect the protein and mRNA levelsof ZO-1，Occludinrespectively.Results Stimulated with different concentration of C-8 ceramide for 24 h，the TEER of cells decreased（F=38.78，P＜0.001）and the OD470increased（F=19.78，P＜0.001）significantly.Results from Western blot and RT-PCR demonstrated significant decrease of ZO-1（F=71.150，P＜0.01；F=4.887，P= 0.014）and Occludin（F=7.703，P=0.002；F=3.637，P=0.048）expression in the AEC Ⅱ with C-8ceramide.Conclusion C-8 ceramidemay disrupt the alveolar epithelial barrier by decreasing expression of ZO-1 and Occludin.

ceramides；tight junction；pulmonary epithelial cell；trans-epithelial electrical resistance

R 563

A

1000-1492（2016）02-0195-05

时间：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.020.htm l

2015-11-23接收

国家自然科学基金（编号：81400058）；安徽省自然科学基金项目（编号：1208085QH165）

1安徽医科大学第二附属医院呼吸内科，合肥 2306012安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，合肥 230032

汪 影，女，硕士研究生；陆友金，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：luyougolden＠hotmail.com

结论C-8神经酰胺可能通过下调紧密连接蛋白的表达增加肺泡Ⅱ型上皮细胞通透性。