北五味子木脂素对酒精性肝损伤小鼠免疫功能的影响

张　媛，李淑波，陈建光，鞠文博，张涵瑜

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林　132013；2.北华大学药学院，吉林 吉林　132013)



北五味子木脂素对酒精性肝损伤小鼠免疫功能的影响

张媛1，李淑波1，陈建光2，鞠文博1，张涵瑜1

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林132013；2.北华大学药学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的观察五味子木脂素对小鼠淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞(NK细胞)的影响.方法应用五味子木脂素高、中、低3个剂量治疗酒精性肝损伤小鼠，联苯双酯对照，观察其对小鼠脏器系数、体液免疫功能、淋巴细胞增殖以及NK细胞活性的影响，利用流式细胞仪和MTT法检测其对淋巴细胞亚群、NK细胞的影响.结果五味子木脂素中剂量组胸腺、脾脏系数明显增加，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；五味子木脂素中剂量组能显著降低CD8+水平，提高CD3+，CD4+水平及CD4+/CD8+比值，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；五味子木脂素中剂量能提高NK细胞活性和T，B淋巴细胞增殖能力，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论五味子木脂素能够增强酒精性肝脏损伤小鼠的免疫功能.

关键词：五味子木脂素；淋巴细胞亚群；NK细胞

【引用格式】张媛，李淑波，陈建光，等.北五味子木脂素对酒精性肝损伤小鼠免疫功能的影响[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：181-185.

五味子具有保肝功能.研究[1]证实：五味子能增强机体对非特异性刺激的防御能力，具有增强肾上腺皮质功能及促进免疫功能的作用.有资料[2-4]表明：五味子具有保肝、增强免疫、抗衰老及抗癌等作用，还具有抗氧自由基及免疫增强作用[4].酒精性损伤性肝炎在我国比较常见，为了研究其损伤机制是否与免疫调控紊乱有关，以及与肝损伤发生、发展和预后的关系，本实验主要研究五味子木脂素对肝功能的影响.结果显示：五味子具有保肝作用，对免疫细胞具有调节作用，可提高小鼠免疫功能.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

昆明小鼠60只，雌雄各半，体质量20～24 g，吉林大学实验动物中心提供(SCXK-(吉)2012-005).实验前于动物房适应饲养，1周后随机分为6组：盐水阴性对照组、五味子木脂素高中低剂量组、酒精模型组、阳性对照组.实验环境条件：温度23～25 ℃，湿度54%～68%，动物自由饮水和进食.

1.1.2主要仪器与试剂

FACSCALIBAR流式细胞仪(美国BD公司);动物台秤、分析天平、无菌手术器械、二氧化碳培养箱、细胞计数器、离心机(北京医用离心机厂)；722分光光度计(日立 F-4600)、微量注射器、恒温水浴箱、24孔和96孔平底细胞培养板、酶标仪、显微镜等(日本，Olympus)； RPMI1640培养液、MTT、小牛血清、青链霉素、1%冰醋酸、1 mol/L的HCL溶液、0.2 mol/L的Tris -HCL缓冲液等(南京建成生物工程研究所)；五味子木脂素(北华大学林学院)，冷藏备用；脂多糖(美国Sigma公司)；FITC染色CD3试剂、PE染色CD4试剂、PE染色CD8试剂(美国Coulter公司产品).

1.2方法

1.2.1造模、分组与用药

60只小鼠随机分为6组，每组10只.全部小鼠在实验期间均正常饮水，普通饮食.实验开始测量体质量，每组小鼠按4 mg/(kg·d-1)酒精灌胃，同时每天酒精灌胃2 h后各组再给予相应的治疗药物，模型组给予生理盐水，阳性对照组给予联苯双酯，低、中、高剂量组分别给予五味子木脂素；正常对照组给予生理盐水，不给酒精.连续给药40 d.给药剂量见表1.

表1各组给药剂量及方法

Tab.1 Dosage and method of drug in each group

1.2.2脏器/体质量比值测定

实验结束时称小鼠体质量，然后眼眶取血，断头处死小鼠，取出胸腺、脾脏，在电子分析天平上称重，脏器系数以mg/kg体质量表示[5].

1.2.3小鼠体液免疫功能测定

采用血清溶血素分光光度法测定血清中溶色素含量.给小鼠腹腔注射5%绵羊红细胞0.2 mL进行免疫，同时开始给药，4 d后摘眼球取血，离心分离血清，稀释500倍后再加入0.5 mL SRBC，37 ℃恒温水浴反应10 min，离心取上清液，加都氏液，于540 nm处测定OD值，记录分析小鼠体液免疫功能，HC50=OD(给药组)/OD(血清半数溶血)×500.

1.2.4小鼠脾淋巴细胞数量增殖情况测定

取各组小鼠脾脏，应用细胞破碎仪制成脾细胞悬液，加入到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，再加入PHA 100 μL，5%CO2、37 ℃培养箱中培养48 h，去上清液，加入MTT 10 μL，置于37 ℃、5% CO2孵箱中孵化2 h，然后加入酸化异丙醇100 μL，震荡完全，置酶标光度计570 nm处测定OD值，记录分析数据.

1.2.5NK细胞测定

取1.2.4小鼠脾细胞悬液，按效应细胞和靶细胞10∶1比例各加100 μL于96孔培养板上，置于37 ℃、5% CO2孵箱中孵化24 h，取上清液100 μL，加底物100 μL，反应5 min，再加0.1 mol/L柠檬酸50 μL，酶标光度仪570 nm处测OD值，计算NK活性：NK=OD(实验管)-OD(自然释放管)/OD (最大释放管)- OD(自然释放管) ×100%.

1.2.6流式细胞术测定淋巴细胞亚群水平

应用流式细胞术检测CD3+，CD4+/CD8+，NK实验结束时，无菌操作取出每组小鼠脾脏,制备脾细胞，将细胞数调整到1×106/mL,然后用预冷的PBS液逐一洗3遍.加入CD3+，CD4+，CD8+和NK细胞抗体，冰浴1 h.每管加1 mL PBS后离心，2 500 r/min离心3 min，弃去上清，每管加入1 μL二抗和50 μL PBS，冰箱内避光30 min后过300目尼龙网，流式细胞仪检测小鼠脾细胞中CD3+，CD4+，CD4+/CD8+和NK细胞水平[6].

1.2.7MTT法测定淋巴细胞增殖反应

无菌取脾后，取脾细胞置于盛有适量无菌Hanks液的平皿中，制成细胞悬液，Hanks液反复洗3次，每次1 000 r/min离心10 min后，将细胞悬浮于培养液中，调整细胞浓度为5×106个/mL.再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，在其中一孔加50 μL DMSO液及甘氨酸缓冲液，另一孔作为对照，置5% CO2、37 ℃孵箱中培养18～22 h.培养结束前4 h再加入MTT(5 mg/mL)50 μL /孔，继续培养24 h.培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，震荡均匀后静止20 min，测定淋巴细胞增殖反应[7].

1.3统计学处理

2结果

2.1各组小鼠症状变化情况

模型组小鼠醉酒状态明显，步履不稳，毛发蓬乱，色泽灰暗，有兴奋、行动迟缓、少动、嗜睡现象；正常对照组无异常变化；五味子木脂素中剂量组的变化不明显；其余各组状态介于二者之间.

2.2五味子木脂素对小鼠胸腺、脾脏系数影响

由表2可见：小鼠脾脏、胸腺系数中剂量组、阳性对照组与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；其他各组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).

表2实验组各组小鼠脾脏、胸腺系数

Tab.2The spleen and thymus coefficient of mice in each group

注：与正常组比较，*：P<0.05；与其他各组比较，#：P>0.05

2.3小鼠体液免疫功能测定结果

由表3可见：五味子木脂素低浓度组、阳性药物对照组与正常对照组比较，小鼠体液免疫功能HC50差异具有统计学意义(P<0.01)；五味子木脂素中、高浓度组与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).说明五味子木脂素3个剂量均能增强小鼠体液免疫，其中以低浓度组为最好.

表3木脂素对小鼠体液免疫功能的影响

Tab.3The influence of lignanoid on the humoral immune function of mice

注：与正常组比较，*：P>0.05，**：P<0.01；***：P<0.05

2.4小鼠脾淋巴细胞数量增殖测定结果

由表4可见:五味子木脂素低浓度组与正常对照组比较，小鼠淋巴细胞增殖有显著差异性，差异具有统计学意义(P<0.01)；五味子木脂素中、高浓度组和阳性药物对照组与正常对照组比较有差异性，差异具有统计学意义(P<0.05)；五味子木脂素3个剂量均能刺激小鼠淋巴细胞增殖，其中以低浓度组刺激强度最高.

表4木脂素对小鼠淋巴细胞增殖的影响

Tab.4Effects of lignanoid on lymphocyte proliferation of mice

注：与正常组比较，*：P>0.05，**：P<0.01；***：P<0.05

2.5小鼠NK细胞功能的测定结果

由表5可见:五味子木脂素低浓度组和阳性药物组与正常对照组比较，小鼠淋巴细胞增殖有显著差异性，差异具有统计学意义(P<0.01)；五味子木脂素中、高浓度组与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；五味子木脂素3个剂量均能增强小鼠NK细胞功能，其中以低浓度组增强强度最大.

表5　木脂素对小鼠NK细胞功能的影响

注：与正常组比较，*：P>0.05，**：P<0.01；***：P<0.05

2.6流式细胞术检测淋巴细胞水平结果

结果显示:五味子木脂素对淋巴细胞CD3+，CD4+，CD4+/CD8+，NK水平产生影响.由表6可见：五味子木脂素中、低剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；五味子木脂素高剂量组、其他各组与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).

表6流式细胞术检测CD3+，CD4+，CD4+/CD8+，NK水平结果

Tab.6Detection of CD3+，CD4+，CD4+/CD8+，NK by flow cytometry

注：与正常组比较，*：P<0.01；#：P>0.05

2.7MTT法测定淋巴细胞增殖反应结果

由表7可见：与正常对照组比较，阳性对照和五味子木脂素中浓度组细胞增殖能力比较差异具有统计学意义(P<0.01)；其他各组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).

表7　MTT法测定淋巴细胞增殖能力结果分析

注：与正常组比较，*：P<0.01；其他各组与正常组比较，#：P>0.05

3讨论

五味子(Schisandra Chinensis (Turcz)Baill)属木兰科植物，成熟、干燥的果实入药，临床多用于久咳虚喘、津亏口渴、遗精、自汗、久泻、神经衰弱、肝炎等症的治疗.五味子具有敛肺滋肾、生津敛汗、涩精止泻的作用.研究[8]证实：五味子能增强机体对非特异性刺激的防御能力，有增强肾上腺皮质功能及促进免疫功能的作用.五味子酚对氧自由基引起的大鼠脑突触和线粒体损伤具有保护作用[9].五味子水提液可降低老龄小鼠血清中总胆固醇含量，降低脑和肝中MDH含量，增强SOD活性，抑制MDA-B活性，随着剂量的增加，作用逐渐增强[10].免疫实验[11]表明：五味子能增加细胞免疫功能.本研究结果表明:在实验设计的剂量范围内，五味子可提高小鼠的免疫功能.

胸腺是中枢性免疫器官，脾脏为外周性免疫器官，对机体的免疫功能具有重要作用.结果表明：五味子木脂素中剂量组可增加小鼠胸腺和脾脏的重量，具有提升免疫器官参与免疫的功能.巨噬细胞是机体免疫防御机制的重要组成成分，具有抗原提呈、非特异性免疫和特异性免疫作用.T，B淋巴细胞具有参与细胞免疫和体液免疫的功能，T，B淋巴细胞和巨噬细胞的增殖能力说明其参与机体免疫功能的强弱.本实验结果显示:五味子木脂素能增加小鼠的T，B淋巴细胞的数量，增强巨噬细胞的吞噬功能.

机体能够维持正常免疫功能状态，有赖于各种免疫细胞，尤其细胞介导的免疫是T细胞亚群之间的相互协调或相互制约.其中CD3+，CD4+，CD8+系统起着相当重要的作用，能产生适度的免疫应答，使之既能清除异物抗原，又不致损伤机体自身组织.当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体细胞免疫功能紊乱.本实验结果显示：模型组CD3+，CD4+及CD4+/CD8+明显低于正常组，五味子木脂素中、低浓度组和正常对照组比较，没有明显差异，无统计学意义，说明其具有与正常对照组一样的免疫功能.五味子木脂素中等剂量对淋巴细胞亚群的增殖有一定影响，主要是能提高CD4+水平，降低CD8+水平，调节淋巴细胞亚群的比例，起到调整细胞免疫功能的作用.

参考文献：

[1] 宋万志，肖培根.中国五味子科药用植物及其木脂素成分[J].中草药，1982，13(1)：40-41.

[2] 陈延镛，杨永庆.红花五味子降谷丙转氨酶有效成分的研究[J].药学学报，1982，17(4)：312-314.

[3] 刘嘉森，王文贵，黄梅芬.湖利脑冲剂的实验研究[J].中草药，1990，21(7)：6-8.

[4] 王文燕，陈建光.五味子的药理作用及开发研究[J].北华大学学报(自然科学版)，2008，8(4)：128-131.

[5] 张庆平，石森林.菟丝子对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].浙江临床医学，2006，8(6)：568-569.

[6] 熊益群，周大桥，姚小萍，等.青芪散对小鼠淋巴细胞亚群及NK细胞影响的实验研究[J].湖北中医杂志，2006，28(4)：3-5.

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[8] 李贯彻.五味子预防支气管哮喘发作有良效[J].中医杂志，1998，39(6):326.

[9] 李莉，刘耕陶.五味子酚和丹酚酸A对H2O2引起大鼠脑神经细胞凋亡的保护作用[J].中药药理与毒理学杂志，1996，10(2):92.

[10] 董秀文，杨晓晖.延缓衰老中药实验研究近况[J].山东中医药大学学报，1997，21(4):315-318.

[11] 李莉.五味子酚对氧自由基损伤小鼠脾淋巴细胞的保护作用[J].药学学报，1997，32(3)：178-182.

【责任编辑：陈丽华】

Effects of Schisandra Lignanoids on the Immune Function of Mice with Alcoholic Liver Injury

Zhang Yuan1，Li Shubo1，Chen Jianguang2，Ju Wenbo1，Zhang Hanyu1

(1.BasicMedicalCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China；2.CollegeofPharmacyofBeihuaUniversity，Jilin132013，China)

Abstract：Objective To observe the effects of schisandra lignanoids(SCL)on the lymphocyte subgroup and NK cells in mice.Method High，medium and low doses of SCL were administrated to treat mice with alcoholic liver injury,bifendate pills as the control.Viscera coefficient of the mice was observed.Humoral immunity function，lymphocyte proliferation and activity of NK cells were tested by Spectrophotometer.The effects of SCL on lymphocyte subsets and NK cells were determined by flow cytometry instrument and MTT method.Results The thymus and spleen coefficients increased significantly in the medium group(P<0.05).Compared with the control group，CD8+ decreased obviously，CD3+，CD4+ and CD4+/CD8+ ratio significantly increased (P<0.05).Medium dose of SCL remarkably improved the activity of NK cells，and the proliferation ability of lymphocyte T and B (P<0.05).Conclusion SCL could enhance the immunity of the mice with alcoholic liver injury.

Key words：Schisandra lignanoids (SCL);lymphocyte subgroup;NK cells

中图分类号：R32

文献标志码：A

作者简介：张媛(1978-)，女，副教授，主要从事组织损伤及药物修复学研究，E-mail：654621062@qq.com；通信作者：鞠文博(1970-)，男，博士，副教授，主要从事组织损伤及药物修复学研究，E-mail：644257703@qq.com.

基金项目：吉林省教育厅科学技术研究项目(2013194)；北华大学大学生创新项目.

收稿日期：2015-11-02

文章编号：1009-4822(2016)02-0181-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.008