燕麦AsNAC1耐盐基因的克隆及初步验证

张胜博，刘景辉，李立军，赵宝平

（内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019）

NAC转录因子家族是一个庞大的家族，其成员超过110个[1]。在拟南芥和水稻全基因组范围内表达谱分析的研究中发现20%～25%的NAC基因被至少一种诸如盐、干旱、冷或ABA的非生物逆境胁迫和植物激素所诱导[2-4]。NAC转录因子对不同逆境胁迫有极大的响应作用[5]。NAC基因家族中的很多成员在植物对非生物逆境胁迫反应中存在差别表达特征，这种在非生物逆境胁迫反应中的差别表达可能反映了NAC基因在植物抗非生物胁迫中具有一定的生物学功能。研究显示：高盐、干旱等逆境胁迫或ABA 能 诱 导 水 稻 SNAC1、OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、OsNAC10、OsNAC045，拟 南 芥 ATAF1、AtNAC019、AtNAC055 和 AtNAC072/RD26 等 NAC转录因子基因的表达，而且功能研究也证明这些NAC基因在抗盐、抗旱反应中具有作用[6-8]。所以NAC转录因子在植物发育和生长调节[9-10]以及逆境应答[11-12]分子网络中扮演着极其重要的角色，是作物遗传工程的优良候选资源。因此，本试验以燕麦VAO-9品种为材料，以本实验室反转录测序得到的一条基因序列设计引物，通过RT-PCR克隆基因全长序列。构建植物表达载体并通过花药侵染法转化拟南芥，在盐胁迫条件下观察其生长状况。为揭示NAC家族基因AsNAC1在植物中的耐盐机制提供试验基础，同时为转基因技术提高植物耐盐能力奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

燕麦VAO-9种子、野生型拟南芥种子、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、大肠杆菌DH5α、克隆载体pMD19-T Vector、过表达载体pCAMBIA1301、DNA 限制性内切酶 、Premix PrimeSTAR HS、DNA Marker等。

1.2 试验方法

1.2.1 RT-PCR克隆AsNAC1的全长序列 总RNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，具体步骤按照试剂盒说明进行。第一链cDNA合成参照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行。设计AsNAC1全长引物FpNAC（GGAAGATCTATGGGGATGGCCGTGC GCAGG）和 RpNAC（CGGGGTTACCTCAGAAGGGGC CCGGCATGCC），FpNAC添加了BglⅡ酶切位点，RpNAC添加了BstEⅡ酶切位点。利用TaKaRa公司的Premix PrimeSTAR HS以cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应体系及程序参照Premix PrimeSTAR HS使用说明书。PCR产物经过检测、回收、纯化后连接至pMD19-T Vector，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过菌液PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆后测序。

1.2.2 过表达载体的构建和转基因植株的获得 将测序正确的阳性质粒与pCAMBIA1301质粒同时用BglⅡ和BstEⅡ双酶切反应，然后将获得的目的片段和表达载体在T4连接酶作用下于16℃水浴过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α并鉴定阳性克隆，提取重组质粒。采用冻融法转化农杆菌，花序侵染法转化拟南芥。

1.2.3 阳性转基因植物的筛选及观察 将收获的拟南芥T0转基因种子用75%酒精消毒10 min，然后无水乙醇消毒10 min，于超净工作台干燥。将种子播种在含25 mg/L潮霉素的MS培养基上，在4℃冰箱中同步化3 d后于光照培养箱中培养，10 d后挑选抗性植株移栽到装有蛭石和营养土（1∶2）的盆钵中培养至成熟，并对植株进行PCR鉴定。收获T1种子。

将T1种子消毒后播种在含25 mg/L潮霉素的MS固体培养基上生长，统计分离比为3∶1的植株移栽并培养至成熟，收获T2种子。

1.2.4 盐胁迫下转基因种子萌发率及植株根长、鲜重和干重测定 将野生型拟南芥种子和T2转基因拟南芥种子灭菌后，播种于含150 moL/L NaCl的MS培养基，每皿播种100粒。4℃同步化3 d后，放置于光照培养箱中培养10 d，每天统计萌发率，以有2片绿色子叶为萌发标志。培养12 d时测量植株根长、鲜重和干重。

2 结果与分析

2.1 燕麦AsNAC1的序列分析

对已知序列全长进行分析，预测ORF序列963 bp，编码氨基酸320个。将序列命名为AsNAC1并提交GenBank，登录号为KU886332。AsNAC1基因全长序列如下：

加粗标示的为起始密码子和终止密码子

AsNAC1所编码的氨基酸序列如下：

2.2 AsNAC1基因生物信息学分析

在NCBI上分析此蛋白质功能结构域，结果见图1，其属于NAC家族。并利用DNAMAN软件对该氨基酸序列与同源性较高的不同植物的NAC家族氨基酸序列构建系统进化树（图2），结果显示AsNAC1蛋白与大麦NAC蛋白和4个小麦NAC蛋白同源性较高，相似度为86%，而与二穗短柄草NAC蛋白的同源相似度为81%，和短花药野生稻、高粱和南荻NAC蛋白同源相似度为66%。进而表明燕麦AsNAC1蛋白与大麦和小麦的NAC蛋白家族进化关系较近，而与其他植物进化关系较远。TMHMM和TMpred预测AsNAC1跨膜结构域，都预测出该蛋白无跨膜结构域（图3和图4）。ProtComp Version预测AsNAC1基因亚细胞定位，结果显示位于细胞核概率较大（图5）。ProtScale预测该蛋白质为亲水蛋白（图6）。

2.3 转基因拟南芥耐盐性分析

为进一步研究AsNAC1基因的功能，成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-AsNAC1（图7，图8，图9）。转化拟南芥后筛选出5株潮霉素抗性株系，并通过PCR鉴定为阳性植株。结果显示5株拟南芥转基因株系中均可检测到外源基因的表达，野生型对照未检测到外源基因表达（图10）。将这5株转基因拟南芥植株收获的种子点播在添加25 mg/L潮霉素的MS固体培养基上，统计得到3个株系的分离比接近 3∶1（表 1）。在 150 mmol/L NaCl胁迫下对转基因拟南芥进行抗性鉴定，野生型和过表达拟南芥种子的萌发率可以看出（图11），从第三天萌发开始，转基因种子每天的萌发率都比野生型高，10 d时的萌发率野生型为43%，而转基因种子萌发率为63%，说明AsNAC1的过量表达提高了拟南芥种子的耐盐能力。未胁迫处理的野生型植株与转基因植株的根长、鲜重和干重无明显差异，在150 mmol/L NaCl胁迫下，转基因植株的根长、鲜重和干重均高于野生型植株。根长的比较结果表明（图12），转基因型株系1、株系2和株系3分别为野生型植株根长的1.39倍、1.52和1.37倍，差异显著；鲜重和干重的比较结果表明（图13、图14），转基因型植株为野生型植株鲜重的1.50倍，差异显著，转基因型植株为野生型植株干重的1.49倍，差异显著。上述结果表明转基因型植株在盐胁迫下表现出更高的耐盐性。

表1 T2转基因拟南芥植株5株系筛选分离比统计

3 讨论

NAC基因是被盐、干旱、冷或ABA等非生物逆境胁迫和植物激素所诱导表达的转录因子[13-16]。本试验克隆在盐胁迫诱导下呈现上调表达的AsNAC1基因，使用NCBI分析其蛋白质功能结构域，结果显示它属于NAC基因家族。通过系统进化树分析AsNAC1蛋白与大麦NAC家族蛋白和4个小麦NAC家族蛋白同源性较高，相似度为86%，而与二穗短柄草NAC家族蛋白的同源相似度为81%，和短花药野生稻、高粱和南荻NAC家族蛋白同源相似度为66%。进而表明燕麦AsNAC1蛋白与大麦和小麦的NAC蛋白进化关系较近。研究显示，高盐等逆境胁迫能诱导水稻 SNAC1、OsNAC5、OsNAC6/SNAC2、OsNAC10 和 ONAC045；拟南芥 ATAF1、ANAC019、ANAC072/RD26和ANAC055等NAC转录因子基因的表达，而且功能研究也证实了这些NAC基因为耐盐基因[17-20]。水稻的OsNAC063基因受高盐诱导表达，拟南芥转OsNAC063基因过表达植株的种子耐盐性增强，对高渗透压的耐受能力提高[20]。NaCl胁迫下野生型和过表达株系的萌发率说明AsNAC1基因过表达可以提高种子萌发时期对高盐的耐受能力。紫花苜蓿MsNAC2转烟草后，转基因烟草植株鲜重和干重均高于野生型[21]。本研究中转AsNAC1基因拟南芥植株鲜干重也显著高于野生型对照组。植物根部是水分吸收的重要部位，根系发达的植物在逆境条件下生活得更好，野生型植株和T3转基因植株NaCl胁迫培养根长对比看出转基因植株根部的抑制程度明显低于野生型植株。结果表明AsNAC1基因过表达可以通过提高根部的伸长和发育来提高高盐胁迫耐受性。

4 结论

本试验通过RT-PCR获得AsNAC1基因全长，包含ORF序列963 bp，编码氨基酸320个。成功构建过表达载体pCAMBIA1301-AsNAC1，并成功转化拟南芥。在拟南芥过表达实验中，盐胁迫条件下转基因植株的表现明显优于野生型。初步判断AsNAC1基因为耐盐相关新基因，可提高植物的抗盐胁迫能力。

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