黄连素对实验性再狭窄模型血管内皮功能的影响

张焕鑫，赵金河湖北医药学院附属人民医院心内科，湖北十堰442000



黄连素对实验性再狭窄模型血管内皮功能的影响

张焕鑫，赵金河
湖北医药学院附属人民医院心内科，湖北十堰442000

［摘要］目的：探讨黄连素对兔颈动脉球囊损伤后血一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）水平及血管形态改变的影响，并初步探讨其改善血管内皮功能的可能机制。方法：将40只日本大耳白兔，随机分为假手术组、模型组、黄连素组和辛伐他汀组，除假手术组外各组均以球囊导管扩张损伤颈动脉内膜，并分别给予生理盐水、黄连素注射液和辛伐他汀配制液2.5 mg/（kg·d）腹腔注射，假手术组仅普食喂养。分别于术后3、7及15天探测各组右颈总动脉直径，并于耳缘静脉采血，检测血清NO含量及血浆ET-1浓度;取15天时的颈动脉切片于光镜下观察。结果：术后3、7及15天，黄连素组血清NO含量与假手术组无明显差异，但显著高于模型组及辛伐他汀组（P＜0.05）；黄连素组和辛伐他汀组血浆ET-1水平与假手术组均无明显差异，但显著低于模型组（P＜0.05）；术后15天，黄连素组和辛伐他汀组血管直径较假手术组均无明显差异，但显著大于模型组（P＜0.05）；黄连素和辛伐他汀组新生内膜中的平滑肌细胞较同期模型组明显减少（P＜0.05），泡沫细胞、纤维结缔组织较少，内皮较完整光滑，内膜增生较轻。结论：黄连素可能通过抑制兔颈动脉球囊损伤后NO浓度降低和ET-1水平升高，抑制新生内膜增生、改善血管内皮功能。

［关键词］心血管再狭窄；内皮功能；黄连素；辛伐他汀；一氧化氮；内皮素-1；兔；实验动物

Influence of Berberine on Venous Endothelial Function of Experimental Model of Restenosis

ZHANG Huanxin,ZHAO Jinhe
Cardiovascular Department of Affiliated People′s Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Abstract Objective:To explore the possible mechanism of berberine improving venous endothelial function initially through discussing its influence on the levels of nitric oxide(NO) and endothelin-1 (ET-1) of the rabbits with carotid artery balloon injury.Methods:Forty rabbits were randomly allocated to sham operation group,the model group,berberine group and simvastatin group,except sham operation group,the rabbit models in other groups were prepared by balloon catheter dilation injuring carotid artery intima,and they accepted peritoneal injection of physiological saline,berberine injection and simvastatin preparation solution in the concentrations of 2.5 mg/(kg·d),sham operation group were fed with common food.The diameters of right common carotid artery in different groups were measured in three,seven and 15 days after the operations,and blood was drawn from auricular vein,the contents of NO and the concentrations of ET-1 were detected;carotid artery slice in 15 days after the operation was observed under light microscope.Results:In three,seven and 15 days after the operations,there was no significant difference between the berberine group and sham operation group in the contents of No,but the berberine group was higher than the model group and simvastatin group significantly (P＜0.05);No significant difference was existed in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in the levels of ET-1,but the berberine group and simvastatin group were lower than the model group remarkably in the levels of ET-1 (P＜0.05);in 15 days after the operation,there was no significant difference in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in vessel diameter,the berberine group and simvastatin group were larger than the model group in vessel diameter (P＜0.05);smooth muscle cells decreased in new intima in the berberine group and simvastatin group compared with the model group at the same time obviously(P＜0.05),foam cells and fibrous connective tissue were less,endothelium was complete and smooth,endometrial hyperplasia was more light.Conclusion:Berberine could inhibit new endometrial hyperplasia and improve vascular endothelial function by decreasing the concentrations of NO and raising the level of ET-1 after inhibiting rabbit carotid artery balloon injury.

Keywords cardiovascular restenosis;endothelial function;berberine;simvastatin;NO;endothelin-1;rabbits;experimental animals

经皮腔内冠状动脉成形术(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty，PTCA)后3～6个月的再狭窄率高达30％～50％［1］，即使行支架植入仍有发生支架内再狭窄的可能。目前对于再狭窄的确切机制尚不十分清楚，但内皮功能障碍是其主要因素之一。研究发现，他汀类药物不仅可有效降低胆固醇，还可减轻炎症反应，抑制平滑肌细胞增殖和迁移，改善血管内皮功能。相关研究表明，黄连素不仅具有抗菌作用，还具有降脂作用，并能抑制平滑肌细胞增殖、改善血管内皮功能［2-3］。本实验以辛伐他汀为对照，通过对内皮源性血管活性因子一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、内皮素-1 (Endothelin-1，ET-1)水平及血管形态的观测，探讨黄连素在改善血管内皮功能方面的作用。

1　材料与方法

1.1动物分组选取健康清洁级日本大耳白兔40只(武汉大学实验动物中心提供)，体质量2.3～2.8 kg，平均(2.6±0.2)kg，雌雄不拘，分笼喂养，自由饮水。1周后随机分为假手术组(n=7)、模型组(n=11)、小檗碱组(n=11)和辛伐他汀组(n=11)。

1.2模型复制与分组处理暴露并游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，于右颈总动脉近心侧距颈内、外动脉分叉4～5 cm处及右颈内动脉起始处用动脉夹夹闭，在右颈外动脉远心侧，距颈内、外动脉分叉约1 cm处结扎。于右颈外动脉结扎处近端穿一细线备用，并剪一“V”型小口(约为管周1/3)，血管钩拉起切口，直视下逆行插入球囊导管(强生公司提供，Φ2.5 mm×20 mm)至动脉夹处，连接压力泵(麦瑞特公司提供)，以5～6 atm扩张球囊，重复3次，30 s/次，缓慢回拉导管，逐段扩张至切口处，退出球囊，在切口近端结扎右颈外动脉。假手术组不行球囊扩张，余步骤同上［4］。术后肌注青霉素80万U/d，连续3天，预防感染。黄连素组予2.5 mg/(kg·d)黄连素注射液(安徽蚌埠制药厂，10 mg/支)腹腔注射，辛伐他汀组予2.5mg/(kg·d)辛伐他汀原粉(美国默克公司，批号：FR-047)配制液腹腔注射，模型组腹腔注射等量生理盐水，假手术组仅予普通饮食，至术后15天实验结束。实验过程中模型组与辛伐他汀组因感染、创伤等原因死亡4只。

1.3右颈总动脉直径超声检测各组动物分别在术后3、7、15天于采血前用全数字化高分辨力彩色超声诊断仪Sequioa 512(Acuson公司)探测各组右颈总动脉管腔直径。

1.4血液采集与生化指标检测各组动物分别于术后3、7、15天空腹耳缘静脉采血4mL，取2mL注入干燥试管，待自凝后，4000r/min离心10分钟，分离血清；余下2mL注入含有7.5％EDTA·Na230μL和抑肽酶40μL的试管中混匀，4℃3600r/min离心10分钟，分离血浆。所有血样均保存于-20℃待测。检测前室温下复融，采用硝酸还原酶法，使用英国CECIL 2041紫外分光光度计检测血浆NO生成量，试剂盒购于南京建成生物工程研究所；采用放射免疫法，使用上海SN-697全自动双探头放射免疫γ计数器检测血浆ET-1水平，试剂盒购于天津九鼎医学生物工程有限公司。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5切片制备及形态学观察术后15天处死全部家兔，暴露并游离右颈总动脉，取自颈内、外动脉分叉以下1 cm处至4～5 cm处约2～3 cm节段，生理盐水冲洗后放入10％中性甲醛固定，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚4 μm)，行HE染色，于光镜下观察受损血管组织形态学改变并照相。

1.6统计学方法实验数据采用SPSS 12.0统计软件进行处理，计量资料以(±s)表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1颈动脉管腔直径超声检测结果显示，术后3天及7天各组之间比较，管腔直径无明显差异(P＞0.05)；至15天时，黄连素组和辛伐他汀组的管腔直径均显著大于此时的模型组(P＜0.05)，且均明显小于3天时的管腔直径(P＜0.05)，但与假手术组和7天时比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，而模型组较假手术组及3、7天时的管腔直径均显著减小(P＜0.05)；黄连素组与辛伐他汀组比较，在各时间点上均无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1　术后3、7及15天4组颈动脉管腔直径比较(±s)　mm

表1　术后3、7及15天4组颈动脉管腔直径比较(±s)　mm

注：*表示与15天时模型组比较，P＜0.05;#表示与同组3天时比较，P＜0.05。

组别　只数　术后3天　术后7天　术后15天假手术组　7　0.66±0.01　0.65±0.02　0.62±0.02*模型组　9　0.67±0.02*　0.66±0.02*　0.43±0.02黄连素组　11　0.69±0.02　0.66±0.04　0.58±0.03*#辛伐他汀组　9　0.70±0.03　0.67±0.05　0.57±0.02*#

2.2血清NO含量球囊损伤后3、7、15天时，黄连素组血清NO含量与假手术组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，且两者均显著高于模型组及辛伐他汀组(P＜0.01)；每组在各时间点间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.3血浆ET-1浓度球囊损伤后3、7、15天时，假手术组、黄连素组和辛伐他汀组血浆ET-1浓度明显低于模型组(P＜0.05)，但黄连素组与辛伐他汀组及假手术组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；每组各时间点间比较，均无明显差异(P＞0.05)。见表3。

表2　术后3、7、15天4组血清一氧化氮含量变化(±s)　μmol/L

表2　术后3、7、15天4组血清一氧化氮含量变化(±s)　μmol/L

注：*表示与模型组比较，P＜0.05;#表示与辛伐他汀组比较，P＜0.05。

组别　只数　术后3天　术后7天　术后15天假手术组　7　70.53±8.19*#　71.47±8.33*#　70.21±16.49*#模型组　9　22.92±5.77　26.15±5.69　31.87±13.33黄连素组　11　60.29±6.77*#　63.55±6.43*#　65.20±12.70*#辛伐他汀组　9　33.51±4.12　38.35±4.33　40.15±16.01

表3　术后3、7、15天4组血浆内皮素-1水平变化(±s)　pg/mL

表3　术后3、7、15天4组血浆内皮素-1水平变化(±s)　pg/mL

注：*表示与模型组比较，P＜0.05;#表示与假手术组比较，P＜0.05。

组别　只数　术后3天　术后7天　术后15天假手术组　7　55.38±7.73*　52.25±7.68*　54.91±10.14*模型组　9　92.39±8.94　93.47±9.12　91.19±15.94黄连素组　11　67.61±7.44*#　61.88±7.33*#　58.39±10.71*#辛伐他汀组　9　67.06±4.58*#　65.38±8.71*#　62.44±13.18*#

2.4组织形态学观察HE染色后，光镜下可见颈动脉壁分为内膜、中膜和外膜，内膜和中膜以波浪状的内弹力板为界，中膜和外膜以外弹力板为界。假手术组颈动脉内膜平滑、无增厚，内膜下可见扁平状内皮细胞，内弹力板完整，平滑肌细胞核呈梭形，见图1。模型组血管内膜增生严重，内膜修复不完整，内弹力板不连续，腔内面不光滑，可见大量平滑肌细胞由中膜向内膜迁移并增生，细胞排列紊乱，并有大量泡沫细胞及纤维结缔组织形成，内膜明显增厚，见图1。黄连素组和辛伐他汀组新生内膜有所增厚，平滑肌细胞增殖、迁移，可见少许泡沫细胞、纤维结缔组织形成，但内皮相对完整光滑，见图1。

图1　组织病理学表现

3　讨论

近年来，对于血管内皮功能的研究一直是血管受损后再狭窄研究中的热点。研究发现，内皮细胞的损伤、动脉弹性以及血清炎性因子可能在亚临床动脉粥样硬化的发生发展中起重要的协同作用［5］。血管内皮细胞不仅具有屏障的作用，还是一个高度活跃的代谢库，可起到抗血栓的作用并且可以合成多种血管活性物质，影响血管舒缩、凝血、抗凝、血液流动性等多方面的功能，对其起到调节作用。血管内皮细胞的损伤以及功能异常可引起多种疾病，是多种疾病的始动环节，尤其对于心脑血管疾病的发生发展起重要作用［6］。

NO和ET-1是两种最重要的内皮源性血管活性因子，二者作用相反，在维持血管正常结构和功能方面起重要作用。ET-1不仅具有强大的长效缩血管、促血小板和单核巨噬细胞聚集、黏附作用，还是强大的促平滑肌细胞增生因子，能刺激细胞外基质的合成。与之相反，NO则是内皮合成和分泌的最重要扩血管物质之一，能够抑制平滑肌细胞的有丝分裂及DNA的合成。正常情况下，血管内皮细胞通过平衡血管舒张因子(NO)和血管收缩因子(ET-1)的含量来维持正常的内皮功能。内皮损伤时，血浆ET水平升高和(或)NO水平下降时，两者比例失衡，可导致血管舒张功能异常［7］。

本实验研究发现，球囊损伤后3、7、15天，黄连素组和辛伐他汀组的血浆ET-1水平明显低于模型组，而与假手术组比较无明显差异，提示黄连素和辛伐他汀具有抑制ET-1释放的作用，治疗过程中ET-1浓度似有降低趋势，可能与内皮功能逐渐好转或恢复有关；黄连素组血清NO浓度显著高于模型组，而与假手术组比较无明显差异，提示黄连素具有抑制NO下降的功能，辛伐他汀组在本实验中升高NO的作用不明显，提示辛伐他汀降低ET-1浓度与升高NO水平的作用可能没有直接关系。同时，15天时，黄连素组和辛伐他汀组的血管直径较模型组大，提示黄连素和辛伐他汀可能通过抑制ET-1的释放和NO的减少，以舒张血管、改善内皮功能；较3天时明显缩小但与7天时比较无显著差异，可能是由于7～15天时血管的代偿性扩张较前加剧，并随着药物对内皮功能的修复作用逐渐增强，使得因内膜受损导致的局部血管收缩与弹性回缩明显缓解所致。结合光镜下形态学观察结果，15天时黄连素组和辛伐他汀组新生内膜有所增厚，有平滑肌细胞增殖、迁移，可见少许泡沫细胞、纤维结缔组织形成，但内皮相对完整光滑，提示黄连素可能通过维持NO/ET-1的相对平衡，抑制平滑肌细胞从中膜向内膜增殖、迁移而减轻新生内膜的增生和血管的重塑。

以往研究显示，黄连素可以上调低密度脂蛋白受体(LDLR)，单独或与其他药物联合应用均可显著降低总胆固醇、低密度脂蛋白、ApoB和甘油三酯含量，增加高密度脂蛋白的表达水平，可以用于舒缓血脂障碍和降低心血管疾病的危险［3，8］；黄连素还具有抗脂质过氧化的作用［9］，故可防止脂质在内膜沉积，减少和抑制低密度脂蛋白氧化生成氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL作为动脉粥样硬化形成的重要危险因素之一，可导致内皮细胞损伤和功能障碍，引起NO合成减少，ET-1分泌增加，而内皮细胞的损伤及功能改变是动脉粥样硬化形成的初始改变［10-11］。因此推测，黄连素亦可能通过降脂、抗氧化作用的途径直接或间接抑制新生内膜增生，保护血管内皮并维持其功能，但尚需更深入的研究来证实。

综上所述，兔颈动脉球囊损伤后腹腔注射黄连素，可使血清NO含量升高、血浆ET-1浓度下降，使管腔直径增加、内膜增生程度减轻，提示黄连素保护血管内皮功能、抑制新生内膜增生和血管重塑的机制可能与其提示黄连素可能通过升高NO浓度和/或降低ET-1水平以维持NO/ET-1的相对平衡有关，但更长时间的影响尚需进一步探究。同时，冠心病的发生发展与一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)的功能异常有密切关系［12］。因此，探讨NOS/NO对内皮功能的影响将是我们下一步研究的重点。

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作者简介：张焕鑫(1978—)，男，硕士学位，副主任医师。研究方向：心血管疾病的中西医结合治疗。

收稿日期：2015-07-20

［中图分类号］R285.5

［文献标识码］A

［文章编号］1004-6852(2016)02-0019-04