血清和尿CMV-DNA定量监测对造血干细胞移植后出血性膀胱炎的诊断意义

陆英 张祥忠 刘文达 刘贵连 袁青 林东军

·论著·

血清和尿CMV-DNA定量监测对造血干细胞移植后出血性膀胱炎的诊断意义

陆英1,2张祥忠1刘文达2刘贵连2袁青2林东军1,2

目的 探讨血清和尿CMV-DNA定量监测对造血干细胞移植(HSCT)后出血性膀胱炎(HC)的诊断意义。方法 回顾性分析2011年9月至2015年12月在中山大学附属第三医院进行HSCT的120例受者临床资料，自预处理前1周开始至移植后100 d，每周1次采用荧光定量PCR检测血清CMV-DNA，对于出现CMV-DNA血症或者尿路刺激征的患者同时检测尿CMV-DNA。采用χ2检验比较CMV血症患者和CMV-DNA正常受者发生HC的比例。P<0.05为差异有统计学意义。结果 在HSCT后100 d内，120例受者中47例(39.2%)出现CMV血症，其中同时合并CMV尿症者16例(占CMV血症患者的34.0%)；73例血清CMV-DNA正常的受者中4例(5.5%)出现CMV尿症。CMV血症患者中，16例(34.0%，16/47)发生HC；而血清CMV-DNA正常的患者中，仅4例(5.5%，4/73)发生HC；两组发生HC的患者比例差异有统计学意义(χ2=16.79，P<0.05)。 20例检出CMV尿症的患者均出现不同程度的尿路刺激征及尿常规异常，考虑为CMV相关性HC，给予抗病毒治疗后获得良好效果。结论 HSCT受者仍有较高的CMV感染率，对于出现CMV血症患者，同时监测尿CMV-DNA有助于早期诊断CMV相关性HC，提高疾病的治愈率。

巨细胞病毒； 出血性膀胱炎； 造血干细胞移植

CMV为疱疹病毒科的双螺旋DNA病毒，在自然界中广泛存在，人类CMV感染较普遍。在器官移植、肿瘤、获得性免疫缺陷综合征等免疫功能受损的患者中，CMV可被激活，进而引起一系列的临床症状，甚至导致患者死亡。因此，CMV感染的早期诊断非常重要。

出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)是造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后并发症之一，在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)受者中发生率为8%～27%[1]。临床症状表现为尿路刺激征、血尿，严重者可出现尿路梗阻以及肾功能衰竭。根据发生时间的不同，可分为早发型与迟发型HC。前者发生在预处理28～72 h内，多与预处理相关，尤其是与包含大剂量环磷酰胺和白消安的化疗方案及血小板低下相关；后者发生在预处理72 h后，多数研究表明与病毒(包括BK病毒、CMV、JC病毒、腺病毒)感染以及移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)相关[2-3]。国外报道迟发型HC与BK病毒感染有很大相关性，而国内人群CMV潜伏感染率高，移植后CMV感染的发病率也明显升高，我国以及亚洲多个临床研究中心的统计结果显示CMV感染是发生迟发型HC的高危因素[4-5]。早期诊断CMV相关性HC有利于尽早使用抗病毒药物治疗，避免严重并发症的出现，从而改善疾病预后。本研究以实时荧光定量PCR检测HSCT受者血液以及尿液中CMV-DNA拷贝数，探讨同时检测以上两种标本CMV-DNA对于临床诊断CMV相关性HC的诊断意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料

回顾性分析2011年9月至2015年12月在中山大学附属第三医院进行HSCT的120例受者临床资料，其中男性69例，女性51例，中位年龄33岁(10～55岁)。原发病包括急性白血病82例，淋巴瘤13例，骨髓增生异常综合征3例，重型再生障碍性贫血11例，多发性骨髓瘤2例，慢性粒细胞白血病9例。其中HLA相合同胞allo-HSCT 54例，HLA相合非血缘allo-HSCT 17例，自体HSCT 25例，HLA半相合同胞allo-HSCT 8例，移植物均为外周血造血干细胞；其余16例为非血缘脐血移植。移植前患者血CMV-IgM以及CMV-DNA检测均为阴性，CMV-IgG均为阳性。

1.2 预处理方案及病毒防治

白血病和骨髓增生异常综合征患者采用白消安+环磷酰胺或阿糖胞苷+白消安+司莫司汀+环磷酰胺方案，淋巴瘤采用卡莫司汀+依托泊苷+阿糖胞苷+马法兰方案，多发性骨髓瘤采用马法兰单药方案，重型再生障碍性贫血采用环磷酰胺+抗胸腺细胞球蛋白方案。其中有1例淋巴瘤以及2例高危白血病患者采用白消安+氟达拉滨+阿糖胞苷方案预处理。从患者接受预处理方案开始，常规使用更昔洛韦预防CMV感染。

1.3 CMV-DNA检测方法

所有受者自预处理前1周开始至移植后100 d，每周1次用干燥管采集外周血，检测血清CMV-DNA。对于血清CMV-DNA增高或者出现尿路刺激征的患者，收集尿液检测尿液上皮细胞CMV-DNA。血、尿CMV- DNA检测均由广州达安临床检验中心完成。采用荧光定量PCR检测CMV-DNA拷贝数，所用试剂盒为广州达安临床检验中心的CMV核酸扩增PCR荧光试剂盒。

1.4 CMV血症、尿症判定标准和HC诊断标准

由于各研究中心诊断CMV血症、尿症的CMV-DNA拷贝数参考值各不相同，尤其目前关于CMV尿症的研究甚少，以下参考值是根据本中心既往经验并结合其他研究[6-7]制定的标准：血清CMV-DNA>2 000 拷贝/mL判定为CMV血症，尿CMV-DNA>500 拷贝/mL判定为CMV尿症。在排除其他疾病(如阴道出血、全身出血体质、细菌或真菌性泌尿道感染) 情况下出现的持续性血尿和下泌尿道症状(如排尿困难、尿频、尿急)，可临床诊断为HC[8]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理。非正态分布计量资料采用中位数表示。计数资料采用百分比表示，采用χ2检验比较CMV血症患者和CMV-DNA正常受者发生HC的比例。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CMV-DNA检测结果和HC发生情况

在接受HSCT后100 d的监测期内，120例受者中47例(39.2%)被诊断为CMV血症，其中16例同时出现CMV尿症(占CMV血症患者的34.0%)；73例血清CMV-DNA正常的受者中，4例(5.5%)出现CMV尿症。

在接受HSCT后100 d的监测期内，20例受者(16.7%，20/120)出现HC。CMV血症患者中，16例(34.0%，16/47)发生HC；而血清CMV-DNA正常的患者中，仅4例(5.5%，4/73)发生HC；两组发生HC的患者比例差异有统计学意义(χ2=16.79，P<0.05)。

2.2 CMV尿症患者的临床特点

CMV尿症患者临床特点和转归见表1。20例出现CMV尿症的患者中，男性12例，女性8例，中位年龄28岁；急性白血病17例，慢性粒细胞白血病1例，骨髓增生异常综合征1例，重型再生障碍性贫血1例；同胞供者6例，无关供者14例。20例患者均出现不同程度的尿路刺激征，包括尿频、尿痛、尿急，16例提示镜下血尿，3例出现肉眼血尿，1例出现肉眼血尿并血凝块。临床考虑为CMV相关HC，即给予抗CMV病毒治疗。治疗前行尿细菌、真菌培养，2例尿培养检测出肺炎克雷伯菌。出现CMV尿症的20例患者中，7例在出现尿路刺激征之前已检测出CMV尿症。

表1 CMV尿症患者的临床特点和转归

注：AML. 急性髓系白血病；CML. 慢性粒细胞白血病；ALL. 急性淋巴细胞白血病；AA. 再生障碍性贫血；MDS. 骨髓增生异常综合征；血尿分度. 依据Droller标准[9]分为Ⅰ～Ⅳ度：镜下血尿为Ⅰ度；肉眼血尿为Ⅱ度；肉眼血尿伴小血凝块为Ⅲ度；肉眼血尿伴血凝块阻塞尿道需用仪器进行血块清除为Ⅳ度

2.3 HC的治疗

在检测出CMV尿症后，即给予注射更昔洛韦治疗(5 mg/kg，每12小时1次)，治疗前行尿细菌、真菌培养，治疗期间每周1次动态监测血清和尿CMV-DNA拷贝数。血清和尿CMV-DNA拷贝数降至参考值以下后，改为口服更昔洛韦直至连续2次CMV-DNA监测均为阴性。血清和尿CMV-DNA均增高的16例患者中，1例CMV尿症持续时间为7 d，11例持续14 d，4例持续21 d；仅尿CMV-DNA增高的4例患者，1例CMV尿症持续时间为14 d，其余3例为7 d。20例HC患者中，14例经更昔洛韦单药治疗后痊愈；3例单用更昔洛韦治疗效果欠佳，在联合膦甲酸钠治疗后痊愈；2例合并尿培养肺炎克雷伯菌阳性的患者经过抗菌及抗病毒治疗后痊愈；另外1例患者经抗病毒治疗血清、尿CMV-DNA均转为阴性后仍有肉眼血尿，考虑泌尿系统GVHD，加用甲泼尼龙治疗后逐渐好转。

3 讨 论

CMV相关性HC的转归与早期抗病毒治疗密切相关，因此我们需要一种可靠的方法做出早期诊断。目前，用于检测CMV的标本以及方法有很多种，ELISA法检测CMV-IgG的阳性率可达100%[10]。根据检测手段的不同，检测CMV的方法可简单分为非分子生物学和分子生物学方法，前者包括血清学方法检测CMV-IgG和CMV-IgM、病毒培养法、病毒抗原血症法以及免疫组织化学法；后者包括PCR法、核酸序列依赖性扩增技术以及核酸杂交法。CMV潜伏性感染时，其DNA复制水平较低；而活动性感染时，CMV-DNA大量复制，因此对其DNA进行定量分析可用于临床上预测CMV疾病的发生。同时，定量PCR还能有效监测抗病毒治疗的疗效，目前该技术已经成为许多HSCT中心诊断和监测CMV感染的标准方法。

本中心常规每周1次对接受HCST的患者进行血清CMV-DNA监测，对出现CMV血症的患者同时监测尿CMV-DNA。本研究中20例HC患者，7例在出现尿路刺激征之前即检测出CMV尿症，14例在出现临床症状后检测尿CMV-DNA，在证实合并CMV尿症后即刻予抗病毒治疗(合并细菌感染的2例患者同时使用抗生素治疗)，最终19例患者均获得了良好疗效，另外1例患者经过治疗，血清、尿CMV-DNA均转为阴性后仍有肉眼血尿，考虑泌尿系统GVHD，加用甲泼尼龙治疗后逐渐好转。国内有文献[11]对非亲缘allo-HSCT后并发HC的病例进行了分析，8例HC中5例与CMV感染有关，此5例CMV相关HC的治疗方法及疗效与本中心相似。

本研究中20例患者根据临床症状诊断为迟发型HC，排除出血体质、血小板低等其他引起泌尿道出血的因素，血清和(或)尿CMV-DNA高于参考值，因此我们考虑为CMV相关HC。由于膀胱穿刺为有创检查，在患者中难以开展，因此我们未能获得CMV感染的病理学证据；但是从治疗转归来看，采用更昔洛韦、膦甲酸钠抗病毒治疗获得了良好效果，说明HC与病毒感染有关。至于是哪一种或者哪几种病毒感染，临床上很难一一检测。本研究中，虽然我们仅进行了CMV相关检查，并没有检查另外一种与HC密切相关的病毒——BK病毒，但根据治疗过程分析，我们并没有使用对BK病毒有效的西地福韦或者环丙沙星类药物即治愈HC。因此，推测这20例患者发生HC可能与BK病毒感染无关。

尿液CMV-DNA定量检测是用于诊断CMV感染的方法之一，主要用于婴幼儿以及肾移植术后CMV感染的检测[12-13]，也有用于诊断CMV相关HC的病例[14]。有研究报道尿液上皮细胞中CMV-DNA载量用于预测婴儿CMV活动性感染是一种简便、有效的方法，并能用于治疗和监测[12]。尚未查询到有关血清联合尿CMV-DNA定量监测对HSCT后HC诊断意义的相关报道。本研究同时检测了120例患者血和尿CMV-DNA，其中20例(16.7%)出现HC，与其他临床中心的报道结果相似[4-5]。出现CMV血症的患者与血清CMV-DNA正常的患者中发生HC的比例差异有统计学意义，提示CMV血症是发生HC的高危因素。对于出现CMV血症的患者，有必要同时监测尿CMV-DNA，以利于早期诊断和早期抗病毒治疗，提高CMV相关性HC的治愈率。此外，血清和尿CMV-DNA均增高的16例患者中，1例 CMV尿症持续时间为7 d，11例持续14 d，4例持续21 d；仅尿CMV-DNA增高的4例患者中，1例CMV尿症的持续时间为14 d，其余3例为7 d。该结果提示，对于血清和尿CMV-DNA均增高的HC患者，我们预计可能需要更长疗程的抗病毒治疗，因此要做好减少抗病毒药物不良反应的相关准备。

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(本文编辑：鲍夏茜)

陆英, 张祥忠, 刘文达, 等. 血清和尿CMV-DNA定量监测对造血干细胞移植后出血性膀胱炎的诊断意义[J/CD]. 中华移植杂志：电子版, 2016,10(3):122-125.

Quantitative monitoring of serum and urine cytomegalovirus after hematopoietic stem cell transplantation and its significance on diagnosing hemorrhagic cystitis

LuYing1,2,ZhangXiangzhong1,LiuWenda2,LiuGuilian2,YuanQing2,LinDongju1,2.

1DepartmentofHematology,2DepartmentofBloodTransfusion,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity, 510630Guangzhou,China

ZhangXiangzhong,Email:bradzxz@126.com

Objective To explore the significance of monitoring serum and urine cytomegalovirus (CMV) DNA on diagnosing hemorrhagic cystitis (HC) after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods We retrospectively analyzed clinical data of 120 HSCT recipients at the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from September 2011 to December 2015. Serum CMV DNA were tested weekly by real-time PCR from 7 days before preconditioning to 100 days after HSCT. For patients with CMV viremia or lower urinary tract symptoms, urine CMV DNA was also detected. Results Within 100 days after transplant, 47/120 (39.2%) patients developed CMV viremia and 16 patients meanwhile developed CMV uremia. Only 4 (5.5%) patients presented CMV uremia in the 73 patients with normal serum CMV DNA. All of the 20 patients with CMV uremia had complaints of lower urinary tract symptoms and were found abnormal urine routine test, then CMV related HC was diagnosed following by anti-virus treatment and obtained complete remission. Conclusions The incidence of CMV infection was still high during HSCT. For patients with CMV viremia, urine CMV DNA surveillance is necessary in order to diagnose HC early and improve the cure rate.

Cytomegalovirus; Hemorrhagic cystitis; Hematopoietic stem cell transplantation

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.03.006

广东省自然科学基金(2014A030313138)

510630 广州，中山大学附属第三医院血液科1，输血科2

张祥忠, Email: bradzxz@126.com

2016-06-14)