HPLC法比较心脏釆血和颈总动脉釆血对家兔水杨酸钠血浆半衰期的影响

魏莹　陈珍　马雪　杨梅　刘丹　廖荣琼　陈小云　张语　谭茜　田瑞敏△

(1.川北医学院药学院，四川 南充　637100；

2.川北医学院本科生，四川 南充　637100)



HPLC法比较心脏釆血和颈总动脉釆血对家兔水杨酸钠血浆半衰期的影响

魏莹1陈珍1马雪2杨梅2刘丹2廖荣琼2陈小云2张语2谭茜2田瑞敏2△

(1.川北医学院药学院，四川 南充637100；

2.川北医学院本科生，四川 南充637100)

摘要目的：观察心脏釆血和颈总动脉釆血对家兔水杨酸钠血浆半衰期的影响。方法：将12只家兔按随机数字单盲法分为心脏釆血组和颈总动脉釆血组(n=6)，经耳缘静脉注射10%水杨酸钠溶液2 ml·kg(-1)，分别于0 min，10 min和40 min后釆血，处理血样，HPLC测定血浆水杨酸的峰面积，计算其半衰期。结果：心脏釆血组半衰期比颈总动脉釆血组明显延长(P<0.05)，颈总动脉釆血组的实验数据较心脏釆血组更为稳定。结论：颈总动脉釆血较心脏釆血对水杨酸钠半衰期的测定更为稳定。

关键词：水杨酸钠；半衰期；心脏；颈总动脉；HPLC

药物半衰期是药动学重要参数，可以揭示机体内药物代谢情况，药物排泄规律等[1-2]。“水杨酸钠血浆半衰期的测定”实验是药理学实验或机能学实验当中的一个重要内容[3]，然而其半衰期的测定结果各医学院实验室差距较大。在该实验操作中，准确，多次，及时的采取足量的动物血液[4]是保证实验成功的重要因素。故本文分别采用了心脏釆血和颈总动脉釆血两种途径釆血，并采用了HPLC测定，观察其对水杨酸钠半衰期测定结果的影响，以期为以后药物血浆半衰期的测定实验中家兔采血方法的改进提供一定依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

健康家兔12只(2.5 kg左右，由川北医学院实验中心提供)。

1.1.2实验器材

Agilent 1260 高效液相色谱仪(Agilent 1200四元泵、柱温箱、VWD检测器、Agilent 1200 色谱工作站)，Mettle AE240电子天平(瑞士梅特勒公司，十万分之一)；哺乳动物手术器械，5 ml注射器及针头，兔台。

1.1.3药物试剂

10%水杨酸钠溶液，1%戊巴比妥钠，1%肝素钠溶液；水杨酸对照品(批号100106-201104)购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1分组与血样采集

将家兔12只随机数字单盲法分为两组：心脏釆血组和颈总动脉釆血组，每组6只；分别将两组家兔用1%戊巴比妥钠溶液(3 ml·kg-1)全身麻醉，颈部正中皮肤做5-7 cm纵行切口；将心脏釆血组的家兔用1%肝素钠溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化；将颈总动脉釆血组的家兔的左侧颈总动脉分离出来，用1%肝素钠溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化，然后在颈总动脉上插管；分别自心脏和颈总动脉取血2 ml；耳缘静脉注射10%水杨酸钠溶液后，分别自心脏和颈总动脉于0、10和40 min各取血2 ml备用。

1.2.2色谱条件[5-6]

水杨酸的含量测定 色谱柱：Wondasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.3%磷酸水(32:18:50)；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：283 nm；柱温：25℃；进样量20 μl。

1.2.3对照品制备

精密称取水杨酸对照品9 mg至10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到含水杨酸0.91 mg·ml-1的对照品溶液母液；精密量取2 ml至25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得0.0728 mg·ml-1的对照品溶液。

1.2.4供试品溶液制备[7]

精密量取血液样品0.5 ml，乙腈2 ml，旋涡振荡2 min，15000 r·min-1离心5 min，取上清夜微孔滤膜过滤，取续滤液20 μl，在上述色谱条件下进样，在高效液相色谱仪上进行检测水杨酸在不同时间点的峰面积，计算其半衰期。

1.3统计学处理

2结果

2.1线性关系考察

在上述色谱条件下，精密吸取对照品适量进样，测定目标物峰面积，以进样量X(μg或μg·μl-1)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，做线性回归，得水杨酸的线性方程分别为Y=1206X+95.575(r=0.9995)；线性范围为2.97~4.83 μg。

2.2精密度试验

分别于0.5 ml 的空白血清中加入4 ml的水杨酸对照品溶液混匀，制得0.0728 mg·ml-1水杨酸浓度的血清样品，按上述色谱条件，精密移取20 μl进样，以水杨酸的峰面积计算RSD(n=6)，结果分别为2.4%，表明精密度良好。

2.3稳定性试验

按“1.2.3”项下方法，分别制备样品，在上述色谱方法下，在0、2、4、8、12、24 h进样测定血样中水杨酸的峰面积，得出峰面积的RSD分别为2.1%。表明该血样在24 h内稳定。

2.4回收率试验

分别于0.5 ml 的空白血清中加入3种不同浓度水杨酸对照品溶液，混匀，7.28、72.8、728 mg·μl-1水杨酸血液样品，按“2.3”项下方法，测定空白血浆中水杨酸的含量，计算回收率及RSD，其结果为95.8%(RSD=2.7%)。

2.5样品测定

按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，“1.2.2”项下色谱条件测定，对不同取血方式和时间点的血样中水杨酸的含量进行测定，样品及对照品色谱图见图1。

2.6心脏釆血和颈总动脉釆血对药物半衰期的比较

实验结果统计值：T值是4.085，P值0.002，见表1。实验结果表明，心脏采血组与颈总动脉釆血组比较半衰期较长(*P<0.05)，颈总动脉釆血组半衰期的测定结果更稳定，与文献报道一致[8]。

3讨论

药物的半衰期是临床给药的参考依据，故半衰期的测定十分重要[9]。“水杨酸钠半衰期的测定”，目前该实验半衰期测定不同时间点血液中的水杨酸钠的光密度值，多采用分光光度法[10-11]，但有关半衰期的测定结果各实验室相差较大[8]。本实验采用HPLC测定水杨酸钠的半衰期，从检测方法上提高准确度减少误差。本实验另一重要影响因素则是定点定量血。目前多采用心脏釆血法[3]，也有改良使用兔耳中央动脉取血法[12]，但这两种方法取血对学生的技术要求较高，很难准时取出足量血，造成测定误差。

(A)对照品HPLC图(1.水杨酸)

(B)样品HPLC图图1　血样中水杨酸含量测定的HPLC图

组 别半衰期(min)心脏釆血组 85.48±30.21颈总动脉釆血组34.47±4.85*

注：与心脏采血组相比，*P<0.05。

综上，笔者分别采取颈总动脉釆血法和心脏釆血法两种方法取血，为了避免由于手术和麻醉所致误差，两组采用均在全麻下进行，该实验结果提示颈总动脉取血法可以缩小实验误差。本实验在样品处理时采用乙晴沉降蛋白，经高速离心后可直接吸取上清液进行测定，方法简捷、易操作、回收率高测定速度快，勿需特殊控制的实验条件。HPLC法测定水杨酸钠的半衰期，灵敏度高，样品用量少，是研究药物药动学的常用方法。

参考文献

1李联营. 试分析药物半衰期与合理用药[J]. 中国现代药物应用, 2014, 8(7): 247-248.

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3郑茜. 医学机能学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2013, 113-114.

4卢新华,喻泽兰,谭斌,等. 药物血浆半衰期的测定实验中家兔采血方法的改进[J]. 郴州医学高等专科学校学报, 2001, 3(2): 136-137.

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6张丽,何林,余继英,等. 反相高效液相色谱法测定水杨酸血药浓度及其应用[J]. 中国药房, 2003, 14(5): 289-291.

7金鸣,张银华,黄河,等. 血浆中水杨酸的高效液相色谱分析[J]. 中国法医学杂志, 2004, 19(2): 86-88.

8张慧芝,李丽芬,李进霞,等. 水杨酸钠血浆半衰期的测定及其意义[J]. 大同医学专科学校学报, 2004, 11(2): 1-2.

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10李姝,李荣,吴红.改进水杨酸钠血浆T1/2测定方法提高实验成功率[J].牡丹江医学院学报, 2009, 30(5): 90-91.

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12范平,陈蓉春. 水杨酸钠血浆半衰期测定方法的改进[J]. 川北医学院学报, 1995, 10(1): 38-39.

Effect of blood samples collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits by HPLC

Wei Ying1, Chen Zhen1, Ma Xue2, Yang Mei2, Liu Dan2,Liao Rong-qiong2, Chen Xiao-yun2, Zhang Yu2, Wang Ling-ling2, Tian Rui-min1△

(1.School of Pharmacy, North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100;2.Students of North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100)

AbstractObjective：To observe the effects of blood samples were collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits. Methods: Twelve rabbits were divided into two groups(n=6)according to the random number and single blind method. Blood samples collected from one group werefrom heart and another from the common carotid artery. Rabbits were injected 10% sodium salicylic solution 2 ml kg-1through ear vein. Blood samples were collected at 0, 10 and 40 min respectively from heart and common carotid artery to measure the half-life of plasma salicylic sodium by high performance liquid chromatograph(HPLC). Results: The half-life in the groups whose blood samples were collected from heart were significantly longer than those in another groups(P<0.05).Theexperimental data in the groups whose blood samples were collected from common carotid artery were more stable. Conclusions: The blood samples from common carotid artery are more stable than those from heart on the half-life of plasma sodium salicylic.

Key Words:Sodium Salicylic; Half-life; Heart; Common carotid artery; HPLC

(收稿日期：2016-1-29)

作者简介：魏莹，女，助教，主要从事中药药效物质基础及质量标准化研究，Email：414697669@qq.com。△通讯作者：田瑞敏，女，讲师，主要从事药理学研究，Email：truimin@126.com。