类风湿性关节炎患者血浆和关节滑液中miR-16的表达

冯忠军，冯彦蕊，闻海丰，孙　寅(.河北医科大学第三医院检验科，河北 石家庄 05005；.济宁医学院附属医院检验科，山东 济宁 709)



·论著·

类风湿性关节炎患者血浆和关节滑液中miR-16的表达

冯忠军1，冯彦蕊1，闻海丰1，孙寅2(1.河北医科大学第三医院检验科，河北 石家庄 050051；2.济宁医学院附属医院检验科，山东 济宁 272029)

[摘要]目的通过检测miR-16在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血浆和关节滑液中的表达，探讨其在RA鉴别诊断以及病情评估中的应用价值。方法应用茎环逆转录引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法检测RA患者血浆、关节滑液以及单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中miR-16的表达水平，以U6snRNA为内参，另有10例骨关节炎(osteoarthritis,OA)作病例对照。结果目的基因miR-16和内参U6snRNA的扩增曲线及熔解曲线均良好，未出现非特异性产物及引物二聚体现象。miR-16在血浆中表达水平显著高于关节滑液和外周血PBMC(P<0.01)；miR-16在RA患者PBMC中的表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)。与OA患者相比，miR-16在RA患者关节滑液中的表达水平显著升高(P<0.01)。血浆中miR-16表达与疾病活动度量表(Disease Activity Score,DAS28)评分呈负相关(P<0.05)，与红细胞沉降率( erythrocyte sedimentation rate，ESR)及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)均无相关性(P>0.05)；PBMC中miR-16表达与DAS28评分、ESR及CRP均呈正相关(P<0.05)；关节滑液中miR-16表达与DAS28评分、ESR及CRP均无相关性(P>0.05)。结论茎环逆转录引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法是灵敏而且特异的miRNA检测方法。血浆和关节滑液miR-16的来源并不相同，在血浆和关节滑液中可能存在不同的miRNA表达谱。miR-16的表达水平可望用于RA与OA的鉴别诊断以及作为RA病情活动度的有效评价指标。

[关键词]关节炎，类风湿；滑液；微RNAs

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.013

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫病，致残率较高，而临床常用的影像学、组织学、血清学等诊断方法存在很大的缺陷。微小RNA(microRNA,miRNA)作为重要的免疫调控分子，通过调控mRNA的翻译，引起蛋白质的表达改变，从而影响生物效应。尽管其功能尚未完全阐明，但研究发现，miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，显示了其作为疾病诊断标志物的某些特征[1-3]。本研究采用茎环逆转录引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应(stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，stem-loop FQ-PCR)法检测RA患者血浆及关节滑液中miR-16的表达水平，并结合疾病活动度量表(Disease Activity Score，DAS28)评分及某些实验室指标进行分析,旨在探讨其在RA早期筛选、鉴别诊断以及病情评估中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料选择2012年4月—2013年1月在河北医科大学第三医院免疫风湿科确诊的RA患者30例,均符合美国风湿病学会1987年修订的RA分类标准。男性8例，女性22例，年龄38～69岁，平均(50.28±7.09)岁，其中16例留取关节滑液,同时记录DAS28评分、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等临床相关资料。骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者10例，来自同期关节骨科门诊并排除其他自身免疫性疾病，男性3例，女性7例，年龄35～67岁，平均(50.90±6.17)岁。正常对照组20例，均排除自身免疫、肝脏、心脑血管疾病,男5例，女15例，年龄32～60岁，平均(48.01±4.11)岁。3组受试者性别和年龄差异均无统计学意义，具有可比性。

所有研究对象均对相关研究知情同意。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂ND-2000型超微量核酸蛋白测定仪(美国Nanodrop公司)，ABI7300型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，miRNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)，Hsa-mir-16荧光定量PCR引物试剂盒及EzOmics实时定量PCR试剂盒(南通百奥迈科生物技术有限公司)。

1.2.2标本采集与总RNA提取采集受试者乙二胺四乙酸二钾(ethylene diamine tetraacetic acid-K2,EDTA-K2)抗凝静脉血3 mL，分别提取血浆和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中总RNA。无菌抽取的关节滑液经离心后取上清液于12 h内提取总RNA。提取方法按照操作说明书进行。纯化的总RNA经纯度和浓度检测(OD260/OD280在1.6～2.0范围)及完整性鉴定(1.2%琼脂糖凝胶电泳出现28 s、18 s和5 s等3条带，并且28 s条带亮度约是18 s条带的1.5～2.0倍)后用于PCR扩增反应。所有样本均于-70 ℃保存待用。

1.2.3实时荧光定量PCR检测miR-16用RNase free水调整上述RNA样本浓度后，根据标本数量，分别为目的基因miR-16和内参基因U6snRNA配制反应液并分装(每个样本反应体积均为20 μL)，全程冰上操作。①miR-16反应体系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；RT primer 0.5 μL；Forward Primer(5μmol) 0.5 μL；Reverse Primer(5 μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 5.5 μL。②U6snRNA反应体系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；U6snRNA Forward Primer(5μmol)0.5 μL；U6snRNA Reverse Primer(5μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 6 μL。向每个反应管中分别加入RNA模板5 μL，样本最终反应体系为25 μL。同时，使用不含模板的阴性对照(no template control,NTC)来判断反应过程中是否出现引物二聚体污染。按照以下反应参数进行PCR扩增，反转录：42 ℃ 60 min，1个循环；预变性：95 ℃热启动10 min，1个循环；扩增：95 ℃变性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，于72 ℃处收集荧光，共40个循环；55～95 ℃每上升1 ℃收集1次荧光。创建熔解曲线，反应参数为：95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～95 ℃，以0.1 ℃/s的速率升温，整个过程连续采集荧光。

1.3数据处理PCR的结果以Ct值表示,数据处理采用比较Ct值法，△Ct目的基因=每个标本的目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct目的基因=处理组△Ct目的基因值-对照组△Ct目的基因值，miR-16与U6相对表达量用2-△△Ct方法计算，2-△△Ct值表示病例组miRNA的表达水平相对于对照组的差异倍数，变化倍数大于>2为高表达，变化倍数<0.5为低表达。

1.4统计学方法应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。由于实验数据并不满足正态分布和方差齐性条件，故数据以中位数(25%～75%)[M(Q1，Q3)]表示，采用非参数秩和检验；相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1扩增产物鉴定经电泳检测，miR-16和U6与预期片段大小(分别为75 bp和100 bp)相符，条带清晰，无拖尾现象。

2.2扩增曲线及熔解曲线分析所有样本扩增曲线呈典型S型，平台期大致平行，提示各孔反应运行良好，且扩增效率基本一致；Ct值在18～35之间，说明本次实验数据有效，可以用来进行基因表达量的对比分析。所有样本解链曲线均为单一峰值，而且峰线窄而尖，Tm值约为78 ℃左右，未出现杂峰，表明PCR产物单一，无非特异性扩增；NTC解链曲线无特异性主峰出现，说明并不存在引物二聚体污染。

2.3miR-16表达水平比较及其与临床指标的关系

2.3.1miR-16在RA血浆中的表达miR-16在血浆中的水平显著高于关节滑液和PBMCs(P<0.01)。关节滑液中的表达水平高于PBMCs，但差异无统计学意义(P>0.05)。miR-16在RA组血浆中的表达水平低于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；在PBMCs中的表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)。与OA患者相比，miR-16在RA患者关节滑液中的表达水平显著升高(P<0.01)。见表1～3。

2.3.2相关性分析血浆中miR-16表达与DAS28评分呈负相关(P<0.05)，与ESR和CRP均无相关性(P>0.05)；PBMC中miR-16表达与DAS28评分、ESR及CRP均呈正相关(P<0.05)；关节滑液中miR-16表达与DAS28评分、ESR及CRP均无相关性(P>0.05)。见表4。

表1　RA患者不同标本中miR-16表达比较

*P<0.05与关节滑液比较#P<0.05与PBMC比较(秩和检验)

表2　RA组和正常对照组血浆和PBMC中

表3　RA组与OA组关节滑液中miR-16表达比较

表4　RA患者不同组织miR-16表达水平与DAS28评分、ESR及CRP的相关性

3讨论

RA是一种严重危害人类健康的、以滑膜组织慢性炎症病变为显著特征的疾病，但早期症状并不典型，确诊时已出现关节进行性破坏而错失最佳治疗时机。人们仍在不断寻找能够用于RA早期筛选的新一代诊断指标。miRNA是一类大小19～23个碱基的内源性非编码单链相对小分子质量RNA，现已发现超过700种，其在血清/血浆中的含量十分稳定，可抵抗RNA酶降解，也可耐受强酸、强碱、煮沸及反复冻融等各种极端条件[1]。近年来在血清/血浆、尿液、唾液及阴道分泌物等体液中陆续发现了miRNA分子的存在[4-6]。体液miRNA与组织/细胞miRNA一样，在不同病理状态下呈现特异性改变，在正常和病理组织中，miRNA表达水平存在差异，即使在不同分化时期的同一组织，其表达水平也不同。miRNA参与了T、B淋巴细胞分化和天然免疫反应，并调节免疫细胞信号转导，在转录后水平通过表达量的上调或下调影响细胞的发育和疾病过程[1]，在炎性细胞的发育、炎性分子的表达等方面都有重要调节作用，最终影响炎性反应的进程和结果。目前至少发现10种miRNA在RA中异常表达(miRNA-16、miRNA-124a、miRNA-132、iRNA-146a、miRNA-155、miRNA-203、miRNA-223、miRNA-346、miRNA-363、miRNA-498)[7]。miRNA-124a和miRNA-363下调，7个上调，只有1个miRNA的研究结果是相互矛盾的，miRNA-132在分离的外周血单个核细胞中高表达，但在血浆样品中与对照组相比表达降低[3]。miR-16位于13号染色体长臂1区4带(13q14)，通过靶向作用bcl-2蛋白的表达而降低细胞的增殖和侵袭能力并诱导细胞凋亡,miR-16极有可能影响炎性因子的表达从而参与炎症的发病过程[2,8]。

Stem-loop RT-qPCR法使用5′端为特殊茎环结构的逆转录引物，与miRNA结合时不与茎环序列严格配对的miRNA无法进行反转录,从而可实现对目标miRNA分子的特异性筛选，采用SYBR Green Ⅰ染料渗入法检测信号灵敏度高,特异性好。miR-16和U6扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳检测和全程熔解曲线分析，结果均表明未出现非特异性扩增和引物二聚体现象，提示熔解曲线分析可有效区分特异及非特异性PCR产物；此外，扩增曲线呈典型S型，指数期明显，平台期一致,CT值基本在有效范围内，提示茎环逆转录引物特异性高，可将目的基因与miRNA前体、同一家族miRNA成员以及基因组DNA等区分开来。我们采用该法检测RA患者血浆和关节滑液miR-16的表达水平，所需样本量也很少，只需提供100 ng左右的总RNA即可检测到miRNA的存在，是一种灵敏而且特异的miRNA定量检测方法。

本研究结果显示，在RA患者关节滑液与血浆中均可检测到miR-16的表达，关节滑液和PBMC中miR-16的表达量差异无统计学意义，但是血浆组miR-16的表达水平却显著高于关节滑液。miR-16的表达量差异如此之大，提示血浆、关节滑液及PBMC中的来源并不相同，彼此之间没有相关性，在血浆、关节滑液及PBMC中有可能存在不同的miRNA表达谱[9]。血浆miR-16的表达水平显著高于关节滑液和PBMC，由此我们推测全身各组织分泌及细胞内RNA的破碎释放极有可能是血浆miR-16的主要来源。与OA患者相比，RA患者关节滑液miR-16的表达水平明显升高，有望成为RA诊断及与OA鉴别诊断的新一代分子标志物。

DAS28评分、ESR和CRP是反映疾病活动度和炎症程度的常用指标。本研究结果显示，miR-16在RA患者PBMC中的表达水平不仅显著高于正常对照组，并且其表达量与DAS28评分、ESR及CRP均呈显著正相关。与相关报道相同[2,10]。提示PBMC中miR-16的表达上调与RA病情活动度和炎症程度有密切关系，miR-16与RA成纤维细胞增殖及滑膜细胞炎症反应密切相关[10-13]。另外，RA患者血浆miR-16的表达与DAS28评分呈显著负相关，但样本数量较少，需要加大样本数量进一步证实数据的稳定性及可重复性。

免疫细胞的参与在RA的发病过程中发挥了十分重要的作用。T细胞可通过细胞间相互作用诱导细胞因子及炎症介质的产生,从而加重机体的炎症反应并最终导致关节组织的破坏。因而miR-16在PBMC(主要为淋巴细胞)的表达水平与血浆、关节滑液相比更能反映患者机体的炎症程度和病情的活动度。滑液miR-16则有可能直接来源于病变滑膜组织以及浸润细胞的分泌，其过度表达与滑膜局部炎症刺激有很大的关系，更能反映关节滑膜的病变程度。miR-16所引起的炎症反应很可能是众多靶基因共同作用并且相互影响的结果，其与DAS28评分的显著相关性也强烈提示在RA错综复杂的病因学网络中，miR-16及其靶基因是非常重要的组成部分。但是目前与RA病程相关的miR-16的靶基因并未明了，miR-16如何参与RA的发病机制，需要进一步研究。

综上所述，关节滑液miR-16可望用于RA与OA的鉴别诊断，血浆miR-16可望用作评估RA病情的有效指标。尽管其详细的作用机制尚不清楚，但不能否定其潜在的诊断价值。而进一步深入研究miR-16及其靶基因的表达及其对靶基因的调控机制，可能为及时阻止RA患者病情发展、降低致残率及提高生活质量带来新的希望。

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(本文编辑：刘斯静)

Expression of miR-16 in plasma and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis

FENG Zhong-jun1, FENG Yan-rui1, WEN Hai-feng1, SUN Yin2

(1.Department of Laboratory Medicine， the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051， China；2.Department of Laboratory Medicine， the Affiliated Hospital of Jining Medical College， Jining 272029， China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the expression levels of miR-16 in plasma and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis(RA),and to explore its value in early differented diagnosis and in prediction of disease severity of RA. MethodsPlasma, peripheral blood mononuclear cell(PBMCs) and synovial fluid were taken from patients with RA and osteoarthritis(OA).The expression level of miR-16 was detected by stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(stem-loop FQ-PCR) with SYBR GreenⅠdye, and using U6snRNA as endogenous control. ResultsBoth of the amplication curves and the dissociation curves of miR-16 and U6snRNA were running well. No primer dimmers were formed, and the products of PCR were specific. The expression level of miR-16 in plasma was higher than those in synovial fluid and PBMCs, respectively(P<0.01). The expression level of miR-16 in PBMCs was higher for RA patients than for healthy controls(P<0.01)， the level in synovial fluid was higher for RA patients than for OA patients(P<0.01). The expression level of miR-16 in plasma was inversely correlated with the Disease Activity Score(DAS28)(P<0.05), but was not correlated with erythrocyte sedimentation rate(ESR) and C-reactive protein(CRP). the miR-16 level in PBMCs was positively correlated with DAS28, ESR and CRP(P<0.05). The miR-16 level in synovial fluid had no correlations with DAS28, ESR and CRP(P>0.05). ConclusionStem-loop FQ-PCR with SYBR Green Ⅰdye was a sensitive and specific method for the quantitative detection of miRNAs. There were distinct profiles in plasma and synovial fluid,and the expression level of miR-16 in synovial fluid can be a marker for differential diagnosis of RA and OA. The expression level of plasma miR-16 can serve as an effective novel indicator on assessment of the clinical disease activity.

[Key words]arthritis， rheumatoid; synovial fluid; microRNAs

[中图分类号]R593.22

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)03-0296-05

[作者简介]冯忠军(1968-)，男，河北泊头人，河北医科大学第三医院主任技师，医学硕士，从事临床检验学研究。

[收稿日期]2014-11-19；[修回日期]2014-12-28