唐古特红景天舒张SD大鼠肺小动脉的活性部位及其作用机制*

李更兄，李占强，盖祥云，南星梅，扎西东主，杨惠莲，靳国恩，吴 萍**，芦殿香***

(1.青海大学医学院；2.青海民族大学药学院)

唐古特红景天舒张SD大鼠肺小动脉的活性部位及其作用机制*

李更兄1，李占强1，盖祥云2，南星梅1，扎西东主1，杨惠莲1，靳国恩1，吴 萍1**，芦殿香1***

(1.青海大学医学院；2.青海民族大学药学院)

目的 研究唐古特红景天舒张大鼠肺小动脉的活性部位及其作用机制。方法 利用大孔吸附树脂制备唐古特红景天95%乙醇提取物的不同洗脱流份(去离子水，30%乙醇，70%乙醇，95%乙醇)。采用大鼠肺小动脉血管环离体灌流技术，筛选药物舒血管作用的活性部位。制备内皮完整及去内皮血管环，验证活性部位舒血管作用的靶点。利用去甲肾上腺素(NE)及氯化钾(KCl)预收缩血管环，明确活性部位的舒血管作用与钙通道的关系。利用左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、四乙基氯化铵(TEA)、氯化钡(BaCl2)预处理血管环，阐释活性部位影响血管张力的机制。 结果 大孔吸附树脂的70%乙醇洗脱流份是唐古特红景天95%乙醇提取物舒张肺小动脉的活性部位。活性部位可剂量依赖性地舒张肺小动脉，其对内皮完整血管环的作用强于对去内皮血管环的作用，两者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。活性部位舒血管的作用与其抑制细胞膜受体门控性钙通道有关。L-NAME、TEA、和BaCl2三种阻断剂能够不同程度地减弱活性部位对肺小动脉血管环的舒张作用。结论 唐古特红景天舒血管作用的活性部位主要富集于大孔吸附树脂70%乙醇洗脱物里，其舒血管的效应主要作用于血管内皮，且呈现剂量依赖性。唐古特红景天舒张大鼠肺小动脉的可能作用机制：1、通过抑制细胞膜受体门控性钙通道，减少Ca2+流入血管平滑肌细胞引起血管舒张；2、作用于肺小动脉内皮，促进内皮细胞释放一氧化氮(NO)至平滑肌使平滑肌舒张；3、作用于肺小动脉平滑肌的钾离子通道，促进通道开放引起血管平滑肌舒张。

唐古特红景天 活性 部位 血管 舒张 作用 机制

课题组前期利用低压氧舱模拟海拔4，500 m的高原低氧环境，研究了唐古特红景天对低氧环境下大鼠肺动脉高压形成的干预作用。我们发现，唐古特红景天具有一定的降低低氧性肺动脉高压及逆转低氧性肺血管重构的作用[1]。我们也发现，唐古特红景天干预低氧性肺动脉高压的机制与其舒张肺小动脉的作用有关，其舒血管活性成分主要富集于95%乙醇提取物。为了明确唐古特红景天95%乙醇提取物舒张肺小动脉作用的活性部位及其作用机制，本研究利用大孔吸附树脂制备了唐古特红景天95%乙醇提取物的四种洗脱流份(去离子水，30%乙醇，70%乙醇，95%乙醇)，利用去甲肾上腺素或氯化钾预收缩大鼠离体肺小动脉血管环 ，进一步分析唐古特红景天干预低氧性肺动脉高压药理作用的活性部位，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[实验动物许可证号SCXK(陕)2012-003，购于西安交通大学动物实验中心，体质量(250±20)g，大鼠自由进食饮水]。唐古特红景天{青海省玉树州治多县藏医院，由青海大学生态环境工程学院张得钧教授鉴定，为景天科植物唐古特红景天[Rhodiolaalgida(Ledeb.)Fu var．tangutica( Maxim.) Fu的干燥根]}。重酒石酸去甲肾上腺素注射液(Norephinephrine，NE，国药准字H12020621，天津金耀氨基酸有限公司)，乙酰胆碱Ach(Acetylcholine，Sigma)，N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME，批号：101150336，Sigma)，四乙基氯化铵(TEA，批号：28460，货号：1040692，Sigma)，氯化钡(BaCL2，批号：1001900129，Sigma)，Krebs-Henseleit(K-H)液(氯化钠118、氯化钾4.7、氯化钙2.5、硫酸镁1.2、磷酸二氢钾1.2、碳酸氢钠25、葡萄糖11.1 mmol·L-1、pH=7.4，无机盐试剂均为市售分析纯试剂)。RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，Alpha 1-2 plus型冷冻干燥机(德国Christ公司)，张力传感器(JH-2，中国北京航空医学研究所)，BL-420F型生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型离体组织器官恒温灌流系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 唐古特红景天经大孔吸附树脂后的不同洗脱流份的制备

取100 g唐古特红景天，剪成小块，用95%乙醇回流提取3次，每次提取1 h，收集提取液，减压浓缩至无乙醇味，加去离子水混悬，经D101大孔吸附树脂吸附，用去离子水、30%乙醇/水溶液、70%乙醇/水溶液、95%乙醇/水溶液洗脱5个柱床体积，分别收集各流份，减压浓缩并经冷冻干燥，得到各流份干燥粉末，置于真空干燥器保存备用。

1.2.2 大鼠肺小动脉血管环的分离及离体血管环灌流实验

20%乌拉坦腹腔注射(0.5mL/0.1kg)麻醉大鼠，仰卧固定，打开胸腔，将心肺快速取出，置于氧饱和的、冰浴的KH液中。剪下肺叶(左肺上叶)，用大头针固定肺叶于冰浴的KH液中。快速钝性分离2～3级肺动脉，分离过程中避免牵拉肺动脉，尽量保持动脉环完整。随后将分离的肺小动脉剪成平均长度为2 mm的血管环。

将肺动脉环固定在上下两根三角形挂钩上，其中一个挂钩连接张力传感器，另外一个挂钩下端固定在通气杆上。实验期间，血管环被浸泡在含有10 mL KH液的组织浴槽内，期间持续通入混合气体(95%O2+5%CO2)，并保持37 ℃恒温。血管环被给予300～400 mg基础张力，并在此环境下平衡约120分钟后进行实验。平衡期间每隔15分钟将组织浴槽内的KH液更换为新鲜的氧饱和的37 ℃ KH液。血管的张力变化通过张力传感器输入信号采集系统，最后呈现并记录在计算机上。舒张率=(药物引发的张力)/1 μmol·L-1NE引发的张力)×100%。实验需要去除血管环内皮时，用细钢丝穿入肺动脉环内，轻柔摩擦肺动脉环。检验血管环内皮完整及去内皮方法：待血管张力平衡后，加入1 μmol·L-1NE，待张力升高至最大并稳定后，加入Ach(10μmol·L-1)，当舒张率大于80%时，表示内皮完整，舒张率小于30%认为血管内皮已去除。

1.2.3 唐古特红景天舒血管作用活性部位的筛选及其作用机制研究

肺动脉环调至基础张力后，平衡至最佳状态。在基础状态下，向浴槽内加入NE(1μmol·L-1)，待肺动脉收缩达到最大值并进入平台期后，向浴槽内累积加入唐古特红景天经大孔吸附树脂后的不同洗脱流份(0.38～1.9mg/mL)，对照组累积加入相同体积的KH液，观察药物对NE预收缩肺动脉张力的影响。实验结束后，用新鲜的氧饱和的37 ℃的KH液连续冲洗三次，直至血管环的张力恢复至基础张力。再向浴槽内加入NE(1μmol/L)，以观察活性部位作用于血管环之后对其活性是否有影响。

阻断剂对活性部位舒张NE预收缩大鼠离体肺动脉的影响的实验方法如下：将肺动脉调整至基础张力，并平衡至最佳状态，向组织浴槽内加入NE(1μmol/L)，待血管环收缩至最大值，并且出现平台期之后，分别加入L-NAME(100μmol·L-1)、TEA(1 mmol·L-1)、BaCL2(1mmol·L-1)，对照组加入相同体积的KH液，待新的平台期出现后，再向各个组织浴槽内累积加入活性部位药液(0.38～1.9mg/mL)，观察张力变化。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 唐古特红景天95%乙醇提取物舒血管作用的活性部位筛选结果(表1)

研究发现，大孔吸附树脂各洗脱流份中，95%乙醇洗脱物收率不足1%，在预实验中发现该部位活性表现不佳，故未进行该流份的后续研究。与30%乙醇洗脱流份相比，70%乙醇洗脱流份对NE预收缩肺小动脉的舒张作用更强，两者比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明70%乙醇洗脱流份是唐古特红景天95%乙醇提取物舒血管作用的活性部位。去离子水洗脱流份在同一浓度下未显示舒血管效应。相反，我们发现该洗脱流份呈现缩血管的作用，其具体的药理作用有待深入研究。

Table 1 comparison of 70% and 30% ethanol eluting part induced relaxing effects on NE pre-contracted intact endothelium rings

2.2 活性部位对NE预收缩内皮完整、去内皮肺小动脉的影响结果(图1，表2)

结果显示，活性部位诱导的剂量依赖性的舒张作用，在内皮完整和内皮去除的肺小动脉环中均可以观察到，但是活性部位对内皮完整的肺小动脉环的最大舒张率显著高于内皮去除的肺小动脉环，说明活性部位舒张肺小动脉的作用一部分是由于其作用于血管内皮，另一部分是其对肺小动脉平滑肌的直接舒张作用所致。我们也发现，在实验结束后，用新鲜的氧饱和的37℃ KH液洗脱血管环至基础张力，再向组织浴槽内加入NE检验血管活性，血管最大收缩率仍然大于100%，且出现平台期，证明活性部位作用于内皮完整的、去内皮的肺小动脉血管环后，血管活性良好，该结果也在一定程度上说明了药物活性部位对血管环无毒性作用。

NE：去甲肾上腺素 Ach：乙酰胆碱

图1 活性部位(THT)对NE预收缩去内皮(A)和内皮完整(B)肺小动脉舒张作用的代表图

Figure 1 Representative curve of active part induced relaxing effects on NE pre-contracted endothelium-denuded
(A)and intact endothelium(B)rings

Table 2 Comparison of active part induced relaxing effects on NE pre-contracted endothelium-denuded and intact endothelium rings

2.3 活性部位对NE与KCL预收缩血管环作用的比较结果(表3)

研究发现，药物活性部位对NE预收缩的肺小动脉血管环具有剂量依赖性的舒张作用，而对KCL预收缩的肺小动脉血管环的舒张作用较弱，两者作用相比差异具有统计学意义。

组别n药物浓度(mg/mL)0．380．761．141．521．90NE组311．01±0．5636．28±2．8570．89±1．1989．18±2．9294．88±0．41KCL组30．004．67±0．839．51±2．2315．39±1．1643．49±2．55t34．01818．43941．97240．78534．473P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

2.4 活性部位对NE预收缩血管环的舒张作用与NO及钾离子通道的关系(表4)

研究发现，活性部位对NE预收缩肺小动脉血管环的舒张作用能够被L-NAME、TEA、BaCL2不同程度地阻断，三组的最大舒张率分别为62.74±5.44、76.08±4.34、58.36±6.19，低于活性部位对照组的最大舒张率(94.88±0.41，P<0.05)。

组别n药物浓度(mg/mL)0．380．761．141．521．90活性部位组311．01±0．5636．28±2．8570．89±1．1989．18±2．9294．88±0．41L-NAME组46．27±2．51∗▲21．23±5．20∗＊40．69±8．43∗51．11±5．98∗＊62．74±5．44∗＊TEA组44．04±0．87∗▲13．70±3．82∗31．46±4．31∗62．33±8．36∗▲76．08±4．34∗▲BaCl2组310．71±3．3019．54±2．61∗34．54±7．92∗41．00±7．58∗58．36±6．19∗F 9．317 19．580 28．476 29．503 37．969P 0．003 <0．001 <0．001 <0．001 <0．001

注：*表示与活性部位组比较P<0.05；▲表示与BaCl2组比较P<0.05；＊表示与TEA组比较P<0.05.

3 讨论

本研究发现，唐古特红景天95%乙醇提取物舒张大鼠肺小动脉的活性部位主要富集于大孔吸附树脂的70%乙醇洗脱流份。活性部位能够诱导NE预收缩的大鼠离体肺小动脉呈现剂量依赖性舒张现象，其作用部分基于内皮，部分基于肺小动脉平滑肌，并且对血管环无毒性作用。

血管张力的维持主要受血管平滑肌的收缩和内皮依赖性舒张两者的动态调控。细胞外Ca2+内流以及细胞内Ca2+释放所产生的Ca2+，在血管平滑肌的收缩中起关键作用。细胞膜上的受体门控性钙通道、电压门控性钙通道在调控细胞外Ca2+内流中起主要作用。活性部位对NE预收缩的肺小动脉血管环具有剂量依赖性的舒张作用，但对KC1预收缩的血管环的作用较弱，说明这种舒张作用与抑制受体门控性钙通道的作用有关，与抑制电压门控性钙通道的关系较小[2-3]。

内皮细胞可分泌内皮细胞衍生舒张因子，研究认为其化学本质是一氧化氮(NO)[4-5]。NO由左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg) 经一样化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)代谢产生后迅速进入平滑肌细胞，继而催化GTP向cGMP转化。cGMP浓度的升高可激活蛋白激酶G(PKG)，活化的PKG阻碍细胞Ca2+的内流并降低血管平滑肌对Ca2+的敏感性，最终引起平滑肌松弛。L-NAME作为内皮NO合酶(eNOS)抑制剂， 可有效地抑制NO的生成。我们的研究发现，L-NAME能够阻断活性部位舒张大鼠离体肺小动脉的作用，说明NO在活性部位舒张肺小动脉的作用中占有重要地位。活性部位可能促进了肺小动脉内皮细胞的L-Arg产生NO，继而产生舒张平滑肌的作用。在研究钾离子通道阻断剂对活性部位舒张肺小动脉的影响的实验中发现，大电导钙激活性钾离子通道(BKCa)和内向整流钾离子通道(KIR)阻断剂(TEA和BaCL2)能够不同程度地阻断活性部位对大鼠肺小动脉的舒张作用，说明活性部位可能促进了钾通道的开放，从而引起血管平滑肌的舒张[6]。根据文献报道，NO-cGMP通路在内皮依赖性的血管舒张中占主要地位，NO诱导的血管舒张作用部分依赖于cGMP、PKG介导的大电导钙激活性钾离子通道(BKCa)的活化。因此我们推测，活性部位诱导的大鼠肺小动脉的舒张作用可能是通过作用于NO-cGMP-PKG- BKCa通路，引起细胞内钙离子水平下降而导致血管发生舒张[7]。

本研究发现，唐古特红景天95%乙醇提取物的大孔树脂去离子水洗脱流份显示出缩血管的效应，我们推测该流份可能减弱了唐古特红景天在整体动物水平对低氧性肺血管收缩和重构的干预作用，课题组近期的工作正在验证该缩血管流份的药理作用及其相关的作用机制。

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Active part of rhodiola algidavar.Tanguticaon vasorelaxation of rat pulmonary artery

Li Gengxiong1，Li Zhanqiang1，Gai Xiangyun2，Nan Xingmei1，Zhaxi Dongzhu1

(1.Medical College of Qinghai University；2. Pharmaceutical college of Qinghai Nationalities University)

Objective To investigate the active part of traditional Tibetan herb Rhodiola algida var．tangutica on inducing rat pulmonary artery vasorelaxatioan.Methods To prepare different eluting part of 95% ethanol extract of traditional Tibetan herb Rhodiola algida var．tangutica by macroporous adsorptive resins(deionized water，30% ethanol，70% ethanol and 95% ethanol).Vascular ring perfusion method invitrowas used to detect the active part and its mechanism concerning vascular endothelium，NO，calcium and potassium ion channels.Results The active part was accumulated in 70% ethanol eluting part of 95% ethanol extract of traditional Tibetan herb Rhodiola algidavar．Tangutica，which showed inducing effect on rat pulmonary artery vasorelaxation.The effect of active part on noradrenaline pre-contracted intact endothelium and endothelium-denuded rings showed significant difference.The effect of active part on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of on KCL.And the effect of pulmonary artery vasorelaxatioan was inhibited by adding L-NAME，TEA and BaCl2.Conclusions The active part is mainly accumulated in eluting part of 70% ethanol extract.The effect of active part is based on vascular endothelium and showed dose dependent manner.The mechanism was included as follows：1.The vasorelaxatioan effect is based on inhibiting receptor-operated calcium channel which reducing intracellular Ca2+levels；2.The active part can increase NO concentration by influencing pulmonary artery endothelium which plays a role in inducing pulmonary artery vasorelaxation；3.The active part can induce vasorelaxation by opening the potassium ion channels which reducing intracellular Ca2+levels.

Rhodiola algidavar.TanguticaActive Part Vessel Vasorelaxation Mechanism

*：青海省科技厅自然科学基金面上项目(2014-ZJ-915)；青海省科技厅自然科学基金青年项目(2015-ZJ-928Q)；国家自然科学基金(81160243)；青海省高原医学应用基础重点实验室项目(2014-Z-Y-07) 李更兄(1990～)，女，汉族，青海籍，在读硕士研究生.**：通讯作者，教授，wupingyixue@163.com；***：通讯作者，教授，ludianxiang@qhu.edu.cn

R96

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.011

2015-10-03