胶体金在不同培养温度鼠疫FI抗原检测中遇到的问题※

谢 辉，于晓涛，李 君，张爱萍，魏柏青

(青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科，811602 西宁)

胶体金在不同培养温度鼠疫FI抗原检测中遇到的问题※

谢 辉，于晓涛，李 君，张爱萍，魏柏青※※

(青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科，811602 西宁)

目的 对比胶体金纸上色谱试验(RGICA)、反向血凝试验(RIHA)及细菌检验对于28 ℃与37 ℃鼠疫菌的敏感性及特异性。方法 28 ℃、37 ℃鼠疫菌培养24 h制备菌液与28 ℃、37 ℃的鼠疫菌感染脏器取材制成的菌悬液分别行反向血凝试验，细菌检验及胶体金纸上色谱试验。结果 37 ℃鼠疫菌悬液及37 ℃鼠疫菌感染动物制备菌悬液，胶体金、反向血凝试验及细菌检验均敏感，28 ℃及28 ℃鼠疫菌感染动物取材制备的菌悬液反向血凝试验、细菌检验敏感，胶体金不敏感。结论 在现场应用与鼠疫监测中反向血凝试验因其具有简便、快速、敏感已被列入标准，28 ℃鼠疫菌胶体金检测敏感性差，检测FI抗原缺乏的鼠疫菌株易漏诊，只能作为辅助诊断。

胶体金 温度 鼠疫 抗原 检测 问题

鼠疫检测通常是细菌学方法与血清学方法联合使用，鼠疫的诊断主要依据细菌培养试验和反向血凝试验。随着免疫胶体金技术日益成熟，免疫胶体金出现取代ELISA等传统检测方法的趋势。但在具体工作中我们发现，胶体金技术在检测野外自毙动物材料时存在不足，例如在2012年玉树地震灾区开展鼠疫防控监测中发现鼠疫菌培养试验及反向血凝试验阳性，而鼠疫胶体金检测FI抗原呈阴性。对此我们开展了相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

EV76标准株由青海省地方病预防控制所菌种专业实验室提供；实验动物由青海省地方病预防控制所动物中心提供；鼠疫FI抗原致敏血球(2012-1)、赫氏培养基(2012-1)由青海省地方病预防控制所自行生产；鼠疫抗原胶体金试剂盒(2012120509)由北京庄迪浩禾生物医学科技有限公司生产；细菌标准比浊管由北京生物药品检定所提供。

1.2 方法

用28 ℃和37 ℃的细菌菌液分别行反向血凝试验、分离细菌检验实验及胶体金纸上色谱试验，用28 ℃和37 ℃的细菌攻毒，攻毒后动物取材分别行反向血凝试验、分离细菌检验实验及胶体金纸上色谱试验。

1.2.1 取EV76标准株接种于0.1%溶血赫氏琼脂培养基，分别置于28 ℃、37 ℃温箱，培养24～48 h，用灭菌盐水冲洗培养物制成菌悬液，用标准比浊管稀释菌悬液(10亿/mL)，分别行细菌培养实验和鼠疫反向血凝试验(RIHA)、鼠疫胶体金纸上色谱试验(RGICA)平行检测。

1.2.2 将上述两种培养物制成菌悬液(10亿/mL)，菌悬液接种小白鼠腹股沟皮下(5只，每只0.5mL)行感染，观察3～5 d，处死动物，取肝脾压印0.1%溶血赫氏琼脂培养基培养，同时各取肝脾1 g研磨加盐水制成1：10脏器悬液行鼠疫反向血凝试验(RIHA)、鼠疫胶体金抗原实验(RGICA)平行检测，以生理盐水与未感染细菌动物脏器作为空白对照。

1.2.3 将制备菌悬液和脏器悬液用生理盐水按1：10稀释后，吸取150 μL滴入F1抗原胶体金试纸条内，5 min后可观察到结果，20 min时终止观察，结果可见两条紫红色线条，C线(质控带)和T线(反应带)皆显色，结果为鼠疫抗原检测阳性；仅见一条紫红色线条，结果为鼠疫抗原检测阴性；无任何线条出现或仅有T线，说明试验无效，重新测试，同时做空白对照。

1.2.4 鼠疫反向血凝试验与细菌培养按《鼠疫诊断标准》[1]进行。

2 结果

2.1 37 ℃细菌菌液与37 ℃脏器悬液经RIHA、RGICA和细菌培养这三种方法同步检测，结果阳性率为100%。

2.2 28 ℃细菌菌液与28 ℃脏器悬液用RIHA和细菌培养检测，结果阳性率为100%，RGICA检测结果为阴性，见表1。

表1 鼠疫RIHA、RGICA和细菌学实验检验比较结果

Table 1 Comparison of detecting Yersinia pestis with RIHA，bacteriology and RGICA

2.3 28 ℃和37 ℃菌液及脏器悬液的反向血凝结果见表2

表2 RIHA测定鼠疫抗原结果

Table 2 The results of detecting Yersinia pestis antigen with RIHA

3 讨论

3.1 试验结果表明，将37 ℃的菌悬液及37 ℃的细菌感染动物取材行RGICA、RIHA和细菌培养实验，阳性率均为100%，说明这三种方法对检测37 ℃细菌敏感。FI抗原为荚膜抗原，在37 ℃条件下鼠疫菌F1抗原含量高，现有资料表明荚膜抗原具有抗吞噬作用，感染动物后，37 ℃细菌因具有FI抗原表现为促巨噬细胞使捕获细菌能力减弱，致动物死亡，死亡动物脏器组织FI抗原含量高，由于小白鼠的平均体温为35.2 ℃～36 ℃，适宜FI抗原的产生。因此，鼠疫菌在动物体内FI抗原产量高，所有特异检测FI抗原的方法皆能检测出阳性结果。

3.2 28 ℃菌悬液鼠疫抗原胶体金检测阳性率为100%。用28 ℃细菌菌悬液感染动物，取材，经鼠疫抗原胶体金检测呈阴性，反向血凝试验阳性率为100%，细菌检测阳性率为100%。28 ℃细菌含有少量FI抗原，胶体金色谱试验依然能检测出阳性结果；28 ℃细菌感染动物后，动物发病死亡取材经胶体金色谱试验不能检测出鼠疫FI抗原，我们对于鼠疫菌进入动物体内后，主要在什么部位繁殖，在动物体内如何代谢，所知甚少[2]。因此，对于同一株菌感染动物后检测结果不同，可能仅因培养温度不同，即在28 ℃培养的细菌感染小白鼠，由于缺乏FI抗原，细菌对巨噬细胞的防御性降低，很容易被白鼠的巨噬细胞消化，因此在体内孵育无法产生FI抗原[3]。本研究结果表明，28 ℃鼠疫菌FI抗原含量少，感染动物后FI抗原含量依然少，值得检验人员注意的是野外现场取材后，按四步检验法，培养物均置于28 ℃温箱，如遇FI抗原缺失的细菌，在细菌难以分离的情况下，胶体金无法测得，容易漏诊。反向血凝试验由于致敏血球制备中抗体是通过全菌免疫自然产生的抗体即“多克隆”抗体，故可检测到50种鼠疫菌毒力相关蛋白[4-5]，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹两种方法，对鼠疫FI抗体组分进行分析，多克隆抗体除免疫球蛋白轻、重链之外，还有一些其他蛋白，约占总蛋白的60%[6]，鼠疫EV菌具有复杂的抗原成分，在感染和免疫方面鼠疫菌许多抗原特定部位中，FI抗原属于被膜或外膜抗原，对这种抗原的性质和特点做过较充分的研究，但其他部位的抗原及相应抗体研究较少。有试验表明，将鼠疫菌的标准株的抗原，通过印迹反应检测鼠疫菌的全膜蛋白电泳后转膜分别与FI的3种抗体结合的实验均出现了交叉反应[7]，可以推测在野外检测材料中存在多种鼠疫抗原，交叉反应的出现进一步证实了用常规方法获得的FI抗体特异性不高。由于制备抗体的免疫原为全菌免疫的抗血清，应有其他免疫蛋白，反向血凝试验能够在动物感染材料中检出含量低的鼠疫FI抗原。RIHA测定鼠疫抗原结果表明，28 ℃鼠疫菌虽然缺失FI抗原，但RIHA依然能够检出，其滴度与37 ℃的细菌感染动物后取材检测RIHA滴度只低一个滴度，这也证明应用多克隆抗体可以检测相应的多种鼠疫抗原。

3.3 从实验研究结果及现场应用来看，鼠疫抗原胶体金试验最主要的问题是漏检，漏检的主要原因除上述FI抗原缺乏的问题外，还存在试剂和样本问题。试剂的灵敏度限制胶体金检测方法的灵敏度，胶体金试剂的灵敏度为10 ng/mL，当检测量低于10 ng/mL时，就容易出现假阴性。样本的原因是由于被检物抗原含量过高时，胶体金法全部不显现阳性条带，出现“前置现象”，将被检物稀释后 ，阳性条带可立即显现，该现象是由于样本抗原浓度明显多于胶体金制备浓度造成比例不适引起[8]。因此，在现场检测中遇到可疑条带不能判断时，首先应稀释样本，建议用不同浓度同时检测避免漏诊。

鼠疫是一种传播迅猛亟需快速诊断判定的传染病，因此鼠疫的早期诊断与鼠疫菌的快速鉴定对于鼠疫的防御与治疗具有重要的意义。以往鼠疫的诊断主要依靠病原菌的分离，这往往受被检材料的腐败程度、取材前患者是否服用过抗生素、病原菌的毒力差异等因素影响，而且鼠疫菌的分离需要时间，因此仅仅靠细菌学诊断是不能满足鼠疫疫源检索、疫情监测、动物鼠疫调查、鼠疫患者诊断早期的需要及现场迅速判定的要求；RGICA采用鼠疫单克隆抗体作为捕捉抗原的探针，捕捉特异的FI抗原具有较强的特异性，由于操作简便、快速，已被检验人员广泛使用，但其敏感性不高，在实际工作中有局限，只能用于初筛检测，检测结果不能作为确诊依据；反向凝集试验检测快、敏感度高，在鼠疫疫情判定和疫源地追溯诊断中依然是经典的检测方法。

[1]卫生部传染病标准专业委员会.WS 279-2008鼠疫诊断标准[M].北京：人民卫生出版社，2008：10.

[2]俞东征.鼠疫动物流行病学[M].北京：科学出版社，2009：166.

[3]Γрецчова，Н.Н.腹膜巨噬细胞对Fra因子缺陷及非缺陷型鼠疫菌吞噬活性的研究[J].地方病译丛，1991，12(1)，11-12.

[4]Lib，jiang L，Song Q，et al.Protein micmarray for Prafiling untibody respor ses to Yersinia pestis live vaccine[J].infect Imrmuni，2005，73(6)：3734-3739.

[5]李敏，李蓓，杨晓艳，等.鼠疫感染兔血清抗体谱分析[J].中国地方病学杂志.2006，25(4)：393-395.

[6]石丽媛，王鹏，唐雪，等.对常规制备的鼠疫FI抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察[J].中国地方病学杂志，2006，25(6)：598-600.

[7]Prior JL，Titball RM.Monoclonal antibodies against Yersinia pestis ipopolysaccharide detect bacteria cultured at 28 degrees C or 37 degrees C[J].Mol Cell Probes，2002，16(4)：253-255.

[8]郑怀竞.免疫学检验室间质评与室内质控.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：80-81.

Explore the problems of colloidal gold paper chromatography in plague FI antigen detection

Xie Hui，Yu Xiaotao，Li Jun，Zhang Aiping，Wei Baiqing

(Qinghai Province Institute of Endemic Disease Prevention and Control，Xining 811602)

Objective Compared the specificity and sensitivity of colloidal gold paper chromatography(RGICA)，reverse indirect hemagglutination assay(RIHA)and bacteria inspection for Yersinia pestis which were cultured at 28 ℃ and 37 ℃，respectively.Methods Yersinia pestis were cultivated 24 h at 28 ℃ and 37 ℃ to prepare with bacteria liquid and infected animals preparation of bacteria suspension and then were respectively performed RGICA，RIHA and bacteria inspection.Results RGICA，RIHA and bacteria inspection were sensitive in 37 ℃ plague bacteria liquid and 37 ℃ plague bacteria infected animals prepared with bacteria suspension.RGICA，RIHA and bacteria inspection were not sensitive in 28 ℃ plague bacteria liquid and 28 ℃ plague bacteria infected animal prepared with bacteria suspension.Conclusion Because of its simple，rapid and sensitive characteristics，RIHA has been used as a diagnostic criteria for plague.the sensitivity of 28 ℃ colloidal gold paper is poor and the absence of f1-negative strains antigen detection may lead to misdiagnosis，it can only be used as a auxiliary diagnosis.

Colloidal gold Temperature Plague Antigen Test Problems

※：国家自然科学基金(81260438)；※※：通讯作者，主任医师，Email：wbq9@163.com 谢 辉(1974～)女，汉族，湖北籍， 主管医师

R378.61

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.008

2015-12-23