藏药三味檀香散对离体大鼠肺小动脉的舒张作用及机制*

李思霖，南星梅，2，李占强，2，党占翠，2，吴 萍**，芦殿香，2***

(1.青海大学医学院；2.青海省高原医学应用基础重点实验室)

藏药三味檀香散对离体大鼠肺小动脉的舒张作用及机制*

李思霖1，南星梅1，2，李占强1，2，党占翠1，2，吴 萍1**，芦殿香1，2***

(1.青海大学医学院；2.青海省高原医学应用基础重点实验室)

目的 研究藏药三味檀香散对离体大鼠肺小动脉的舒张作用并探讨其可能机制。方法 利用去甲肾上腺素(NE)和氯化钾(KCl)预收缩离体大鼠肺小动脉，比较三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的舒血管作用；研究不同工具药对醇提物舒血管作用的影响。结果 三味檀香散醇提物和水提物均可抑制NE(1μmol·L-1)引起的肺小动脉的收缩作用。其中，醇提物的舒血管作用更优，两者比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。在浓度为0.3、0.9mg/mL时，水提物对KCl(60mmol·L-1)预收缩血管环的作用优于醇提物(P<0.05)。在0.6、0.9mg/mL时，一氧化氮合酶阻断剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，100μmol·L-1)和前列环素合酶阻断剂吲哚美辛(IMT，10μmol·L-1)均能抑制醇提物对肺小动脉环的舒张作用(P<0.05)，在0.9mg/mL浓度时，IMT的阻断作用优于L-NAME。电压依赖性K+通道(Kv)阻断剂4-氨基吡啶(4-AP，1mmol·L-1)、内向整流K+通道(KIR)阻断剂氯化钡(BaCl2，1mmol·L-1)、钙激活K+通道(KCa)阻断剂四乙基氯化铵(TEA)均可抑制醇提物对肺小动脉环的舒张作用(P<0.05)。结论 三味檀香散95%醇提物对NE预收缩血管环的舒张作用优于水提物。药物醇提物舒张大鼠肺小动脉的可能作用机制：1)通过抑制细胞膜受体门控性钙通道，减少Ca2+流入血管平滑肌细胞引起血管舒张；2)作用于肺小动脉内皮，促进内皮细胞释放一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)至平滑肌使平滑肌舒张；3)作用于肺小动脉平滑肌的钾离子通道(Kv，KIR，KCa)，促进通道开放引起血管平滑肌舒张。

三味檀香散 提取物 血管舒张作用 机制

藏药三味檀香散，又名赞旦松汤，原载于藏医学经典著作《四部医典》，由檀香、肉豆蔻、广枣三味组成，是藏医临床治疗“心热病”的经典常用藏医药方。杨梅等将大鼠置于模拟海拔5000 m的低压氧舱内，研究三味檀香散对大鼠肺动脉压和右心室肥厚重构的影响时发现，三味檀香散不仅可以有效降低HAPH大鼠的平均肺动脉压，而且明显减轻HAPH大鼠右心室的重构[1]。为了明确三味檀香散干预低氧性肺动脉高压发生的机制，本研究制备了三味檀香散95%乙醇提取物和水提物，利用去甲肾上腺素(NE)和氯化钾(KCl)预收缩大鼠离体肺小动脉血管环，观察三味檀香散醇提物和水提物对预收缩血管环的影响，以此分析药物药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[实验动物许可证号SCXK(陕)2012-003，西安交通大学动物实验中心，体质量(250±20)g，大鼠自由进食饮水]。三味檀香散(青海省藏医院)。重酒石酸去甲肾上腺素注射液(Norephinephrine，NE，国药准字H12020621，天津金耀氨基酸有限公司)，N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME，批号：101150336，Sigma)，四乙基氯化铵(TEA，批号：28460，货号：1040692，Sigma)，4-氨基吡啶(4-AP，货号：275875，Sigma)，吲哚美辛(IMT，货号：18280，Sigma)，氯化钡(BaCL2，批号：1001900129，Sigma)，Krebs-Henseleit(K-H)液(氯化钠118，氯化钾4.7，氯化钙2.5，硫酸镁1.2，磷酸二氢钾1.2，碳酸氢钠25，葡萄糖11.1mmol·L-1；PH=7.4；无机盐试剂均为市售分析纯试剂)。RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，Alpha1-2 plus型冷冻干燥器(德国Christ公司)，张力传感器(JH-2，中国北京航空医学研究所)，BL-420F型生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型离体组织器官恒温灌流系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的制备

95%乙醇提取物制备：取三味檀香散药粉30.00 g，置于500 mL烧瓶中，加入150 mL 95%的分析乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸浓缩至膏状物，再用去离子水定容至400 mL。分装并置于-20 ℃冰箱内备用。

水提物制备：取三味檀香散药粉30.00 g，置于500 mL烧瓶中，加入150 mL纯净水，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸浓缩至膏状物，再用去离子水定容至400 mL。分装并置于-20 ℃冰箱内备用。

1.2.2 大鼠肺小动脉血管环的分离及离体血管环灌流实验

20%乌拉坦腹腔注射(0.5mL/0.1kg)麻醉大鼠，仰卧固定，打开胸腔，将心肺快速取出，置于氧饱和的、冰浴的KH液中。剪下肺叶(左肺上叶)，用大头针固定肺叶于冰浴的KH液中。快速钝性分离2～3级肺动脉，分离过程中避免牵拉肺动脉，尽量保持动脉环完整。随后将分离的肺小动脉剪成平均长度为2 mm的血管环。

将肺动脉环固定在上下两根三角形挂钩上，其中一个挂钩连接张力传感器，另外一个挂钩固定在通气杆上。实验期间，血管环被浸泡在含有10 mL KH液的组织浴槽内，期间持续通入混合气体(95%O2+5%CO2)，并保持37 ℃恒温。给予血管环300～400 mg基础张力，并在此环境下平衡约120 min后进行实验。平衡期间每隔15 min将组织浴槽内的KH液更换为新鲜的氧饱和的37℃ KH液。血管的张力变化通过张力传感器输入信号采集系统，最后呈现并记录在计算机上。舒张率=(药物引发的张力)/1μmol·L-1NE或60mmol·L-1KCl引发的张力)×100%。

1.2.3 三味檀香散对NE和KCl预收缩血管环的作用及其机制研究

肺动脉环调至基础张力后，平衡至最佳状态。在基础状态下，向浴槽内加入NE(1μmol·L-1)，待肺动脉收缩达到最大值并进入平台期后，向浴槽内累积加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)或者水提物(0.3～1.2mg/mL)，对照组累积加入相同体积的KH液，观察药物对NE预收缩肺动脉张力的影响。

肺动脉环调至基础张力后，平衡至最佳状态。在基础状态下，向浴槽内加入KCl(60mmol·L-1)，待肺动脉收缩达到最大值并进入平台期后，向浴槽内累积加入三味檀香散95%乙醇提取物或水提物(0.3～1.2mg/mL)，对照组累积加入相同体积的KH液，观察药物对KCl预收缩肺动脉张力的影响。

阻断剂对三味檀香散舒张NE预收缩大鼠离体肺动脉影响的实验方法如下：将肺动脉调整至基础张力，并平衡至最佳状态，向组织浴槽内加入NE(1μmol/L)，待血管环收缩至最大值，并且出现平台期之后，分别加入L-NAME(100μmol·L-1)、IMT(10μmol·L-1)、4-AP(1mmol·L-1)、BaCL2(1mmol·L-1)、TEA(1mmol·L-1)，对照组加入相同体积的KH液，待新的平台期出现后，再向各个组织浴槽内累积加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)，观察张力的变化。

1.2.4 统计学处理

2 结果

2.1 三味檀香散醇提物和水提物对NE预收缩肺小动脉舒张率(%)影响的结果(表1)

Table 1 95% ethanol and aqueous extracts of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表1显示，三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈剂量依赖性地舒张NE预收缩的肺小动脉。与水提物相比，95%乙醇提取物对NE预收缩肺小动脉的舒张作用更优，两者比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 三味檀香散醇提物和水提物对KCl预收缩肺小动脉舒张率(%)影响的结果(表2)

Table 2 95% ethanol and aqueous extract of Sanweitanxiang on KCl pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表2显示，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈剂量依赖性地舒张KCl预收缩的肺小动脉。在浓度为0.3、0.9mg/mL时，水提物对KCl预收缩血管环的作用优于醇提物(P<0.05)。

2.3 L-NAME和IMT预处理对三味檀香散醇提物舒张NE预收缩肺小动脉舒张率(%)作用影响的结果(表3)

Table 3 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation treated by L-NAME and IMT

*：与对照组比较，P<0.05；▲：与L-NAME组比较，P<0.05.

表3显示，三味檀香散醇提物对NE预收缩肺小动脉血管环的舒张作用能够被L-NAME、IMT不同程度地阻断，两组的最大舒张率分别为61.07±1.74、31.73±0.58，低于对照组的最大舒张率(79.73±2.71，P<0.05)。在浓度为0.6、0.9mg/mL时，L-NAME和IMT均能阻断醇提物对肺小动脉环的舒张作用(P<0.05)，在0.9mg/mL时，IMT的阻断作用优于L-NAME。

2.4 4-AP、BaCl2和TEA预处理对三味檀香散醇提物舒张NE预收缩肺小动脉舒张率(%)作用影响的结果(表4)

Table 4 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation in presence of 4-AP，BaCl2and TEA

*：与对照组比较，P<0.05；▲：与4-AP组比较，P<0.05；△：与BaCl2组比较，P<0.05.

表4显示，三味檀香散醇提物对NE预收缩肺小动脉血管环的舒张作用能够被4-AP、BaCl2和TEA不同程度地阻断，三组的最大舒张率分别为63.00±1.67、21.42±0.88、39.59±0.35，低于三味檀香散对照组的最大舒张率(79.73±2.71，P<0.05)。在浓度为0.6、0.9mg/mL时，BaCl2的阻断作用优于4-AP和TEA(P<0.05)。

3 讨论

血管张力的维持主要受血管平滑肌的收缩和内皮依赖性舒张两者的动态调控。细胞外Ca2+内流及细胞内Ca2+释放所产生的Ca2+，在血管平滑肌的收缩中起关键作用。细胞膜上的受体门控性钙通道、电压门控性钙通道在调控细胞外Ca2+内流中起主要作用。

本研究发现，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物均可呈剂量依赖性地舒张NE和KCl预收缩的肺小动脉。其中，95%乙醇提取物对NE预收缩血管环的舒张作用更优，而醇提物和水提物对KCl预收缩的肺小动脉无明显的舒张作用(最大舒张率仅在35%左右)，说明这种舒张作用与抑制受体门控性钙通道的作用有关，与抑制电压门控性钙通道的关系较小[2-3]。

血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)可以催化L-精氨酸生成NO，NO进入血管平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶，产生cGMP，通过cGMP依赖性蛋白激酶使Ca2+内流减少，增加肌浆网上钙ATP酶对Ca2+的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管发生舒张[4]。

我们的研究结果发现，L-NAME预处理能降低三味檀香散95%醇提物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通过NO途径介导血管舒张的作用。血管内皮细胞还可产生PGI2。PGI2可以作用于血管的平滑肌细胞，使细胞内cAMP生成增加，从而导致血管的舒张。本研究显示，用吲哚美辛抑制环氧合酶可以减弱药物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通过环氧合酶途径发挥血管舒张的作用[5]。

在研究K+通道阻断剂对三味檀香散舒张肺小动脉的影响的实验中发现，电压依赖性K+通道(Kv)阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)、大电导钙激活性钾离子通道(BKCa)和内向整流钾离子通道(KIR)阻断剂(TEA和BaCL2)能够不同程度地阻断三味檀香散醇提物对大鼠肺小动脉的舒张作用，说明药物可能促进了钾通道的开放，从而引起血管平滑肌的舒张[6]。根据文献报道[7]，NO-cGMP通路在内皮依赖性的血管舒张中占主要地位。NO诱导的血管舒张作用部分依赖于cGMP、PKG介导的大电导钙激活性钾离子通道(BKCa)的活化。因此我们推测，三味檀香散95%乙醇提取物诱导的大鼠肺小动脉的舒张作用可能是通过作用于NO-cGMP-PKG- BKCa通路，引起细胞内Ca2+水平下降而导致血管舒张。

[1]陈宏，赵媛，李亚楠，等.三味檀香散预处理对低压低氧性大鼠右心室重构的影响[J].青海医学院学报，2015，36(3)153-157.

[2]VS Alfredo Augusto，FJBD Lima，TSD Brito，et al.Vasorelaxation induced by methyl cinnamate，themajorconstituent of the essential oil of Ocimum micranthum，in rat isolated aorta[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2014，41(10)：755-762.

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Research on the Effect and Mechanism of SANWEITANXIANG Powder on Inducing Rat Pulmonary Artery Vasorelaxation

Li Silin1，Nan Xingmei1，2，Li Zhanqiang1，2，Dang Zhancui1，2，Wu Ping1**，Lu Dianxiang1，2***

(1.Medical College of Qinghai University； 2.Key laboratory of application and foundation for high altitude medicine research in Qinghai province)

Objective To investigate the Tibetan medicinal complex Sanweitanxiang powder(SWTXP)on rat pulmonary artery vasorelaxatioan in vitro and it′s mechanism.Methods NE and KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings methodinvitrowas used to detect the effects of aqueous extract and 95% ethanol extract of SWTXP.The effects of different tool drugs on rat’s pulmonary artery vasorelaxation by 95% ethanol extract were studied.Results The effect of pulmonary artery contraction with NE was inhibited by the aqueous extract and 95% ethanol extract.The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the aqueous extractand showed significant statistical difference(P<0.05).The effect of aqueous extract on KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the 95% ethanol extract at concentration of 0.3mg/mL and 0.9mg/mL(P<0.05).And the effect of pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was inhibited by adding L-NAME(100μmol·L-1)and IMT(10μmol·L-1)at 0.6mg/mL.And IMT performed a better inhibition effect than that of L-NAME at 0.9mg/mL(95% ethanol extract).Additionally，the pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was also inhibited by 4-AP(1mmol·L-1)，BaCl2(1mmol·L-1)and TEA(1mmol·L-1).Conclusions The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the deionized water extract.And the mechanism weve included as follows：1)The vasorelaxation effect was based on inhibiting receptor-operated calcium channel which reducing intracellular Ca2+levels；2)The 95% ethanol extract could increase NO and PGI2concentration by influencing pulmonary artery endothelium which played a role in inducing pulmonary artery vasorelaxation；3)The 95% ethanol extract could induce vasorelaxation by opening the potassium ion channels(Kv，KIRand Kca)

Sanweitanxiang powder Extracts Vasorelaxation Mechanism

*：青海省人力资源和社会保障厅2015年度留学人员科技活动择优资助项目[青人社厅函(2015)386号，青人社厅函(2015)522号] 李思霖(1988～)，女，汉族，黑龙江籍，在读硕士研究生.**：通讯作者，教授，wupingyixue@163.com；***：第一通讯作者，教授，ludianxiang@qhu.edu.cn

R96

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.012

2016-04 -04