铜污染对延胡索生长和铜积累的影响

余顺慧，刘双琳，方荣美，董凯馨，张 静，祁俊生

（重庆三峡学院三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州404100）

铜污染对延胡索生长和铜积累的影响

余顺慧，刘双琳，方荣美，董凯馨，张 静，祁俊生＊

（重庆三峡学院三峡库区水环境演变与污染防治重庆高校市级重点实验室，重庆万州404100）

为阐明Cu2＋污染对延胡索的毒害机理，采用土培法对延胡索进行不同Cu2＋浓度的处理，探讨重金属对其生长、抗氧化酶活性和Cu2＋积累的影响。结果表明：Cu2＋污染下，延胡索生长受抑制，生物量下降；明显影响延胡索的抗氧化酶活性，即随着Cu2＋处理浓度的增加，CAT、POD及SOD的酶活性变化呈先升后降趋势；明显影响延胡索叶绿素含量，除Cu2＋浓度在150mg／kg时，叶绿素含量略有增加外，总体呈下降趋势；随着Cu2＋处理浓度的增加，延胡索地下块茎对Cu2＋的积累逐渐增多，在Cu2＋浓度为250mg／kg时Cu2＋含量增加速度最大。生产上应注意土壤中的Cu2＋含量。

铜污染；延胡索；生长；铜积累

铜是植物微量营养元素，过量的铜会对植物造成危害。自然界中，由于铜矿的开采，金属冶炼及三废的排放，含铜农业化合物的使用，有机肥的施用，以及生活污水的排放，使农田土壤含Cu量显著增加。由于中药材的生长需要吸收水分以及土壤中的营养元素，从而使得铜也在体内积累，之后在用来治疗疾病时就会对人类的健康造成威胁。中药用来治病、防病的历史在我国已经有上千年，中药对于我国来说是一种非常重要的商品，首先应对人体无毒害作用。如果中药材被金属污染，不但不能用来治病，而且潜在威胁人体的健康。重金属在中药材中的含量问题，已经有不少学者关注，他们普查了100种中药材，实验结果显示，重金属在中药材中是普遍存在的，而且一些药材中还有很高的含量。自20世纪90年代以来多起中药中重金属超标事件的发生，引起了各界的关注，这使得国际医药市场的热门话题中中药材问题，一再出现，这不仅严重损害中国在国际的形象，也受到很大经济损失，解决中药材中重金属问题，已经势在必行。因此，研究土壤中重金属污染对中药材生长的影响具有重要意义。中药材种类繁多，本研究以延胡索为实验材料，延胡索是著名的“浙八昧”之一，从明代以前就开始种植［3］。近年来，由于重金属污染以及病虫危害等原因，延胡索的产量一再降低，品质也大不如前。延胡索具有药效的重要指标之一是含有生物碱，以往研究延胡索主要测定生物碱含量，有关重金属对延胡索的产量和品质的影响鲜有报道。本实验室用重金属铜、铅等胁迫狗牙根以研究其耐性机理，并取得了一定的成绩［47］。为了提高延胡索的产量、优化其质量，以及提高经济效益，为栽培模式提供实践指导和理论依据，本试验通过对延胡索进行不同铜浓度的处理，从而探讨重金属对其生长的影响。

1材料与方法

1．1材料

供试材料来自浙江省常规栽培延胡索品种（Oorydalis yanhusuo W．T．wang），由重庆三峡学院百安校区试验基地提供。

1．2试验方法

采用5个处理，1个对照，3组平行，盆栽试验，每盆装5kg小粉土，向小粉土中分别加入硫酸铜，混和均匀，其含铜剂量分别为0mg／kg、100mg／kg、150mg／kg、250mg／kg、350mg／kg和400mg／kg，重复3次，每盆种植延胡索5株，对照（CK）不含铜，定期检查生长情况。供试土壤肥力基础为有机质89%，全氮0．23%，水解氮12．58mg／kg，速效钾50．34mg／kg，速效磷11．34mg／kg，铜13．4mg／kg。

1．3测定指标与方法

在延胡索出现伤害症状后，收获，取其地下块茎洗净称鲜重，烘箱中80℃烘干至恒重，称重；采用丙酮－乙醇分光光度法［8］测定叶绿素含量；采用南京建成生物工程研究所购买的SOD、POD试剂盒测定SOD活性和POD活性；采用分光光度法［9］测定CAT活性。

收获后，延胡索地下块茎分别用自来水、去离子水冲洗3次，80℃烘干，粉碎后，精确称取延胡索各样品0．200 0g，加入酸液（浓HNO3∶浓H2SO4＝4∶1），同时做空白组；用MARS240微波消解系统消解以上溶液后，冷却。过滤（滤液在25mL容量瓶中定容），保存在塑料瓶中，样品中Cu2＋含量（mg／kg干重）用AA－6300原子吸收分光光度计测定。

1．4统计分析

试验数据采用SPSS11．5进行统计分析和处理，并应用Sigmapiot10．0软件作图。

2结果与分析

2．1铜污染对延胡索生长的影响

如表所示，随着Cu2＋处理浓度的增加，延胡索地下块茎的生物量呈现递减趋势。不同Cu2＋处理条件下生物量差异不显著（P＞0．05）。表明延胡索对Cu2＋有一定的耐性。Cu2＋是植物生长发育所必需的微量营养元素，延胡索地下块茎的生物量随着Cu2＋处理浓度的增加呈递减趋势，对植物生长有利的Cu2＋浓度范围与植物的种类有关［10］。研究表明，在Cu2＋处理浓度为350mg／kg时延胡索地下块茎鲜重和干重减少幅度突然增加，鲜重由250mg／kg土的2 6．6 0%增至3 5 0mg／kg土的58．62%，干重由250mg／kg土的52．67%增至350mg／kg土的72．71%（均和对照相比），说明，Cu2＋污染浓度350mg／kg对延胡索产量和生长有明显的影响，在生产上要注意土壤中Cu2＋含量。

2．2延胡索抗氧化酶系统在铜污染下的变化特征

2．2．1SOD酶活性 植物体内存在一个抗氧化酶系统，由SOD、POD、CAT三者组成［5－6］，三者的相互协调作用，能有效清除植物细胞内的自由基和过氧化物。能清除细胞内活性氧自由基的酶（主要是SOD）。在重金属胁迫的逆境条件下，延胡索细胞内产生的大量活性氧自由基，被SOD及时有效的清除，从而保护植物不被重金属污染［5－6］。由图1可知，随着Cu2＋浓度的增加，酶活性呈先上升后下降的变化趋势，在Cu2＋浓度为150mg／kg时酶的活性最高，由对照0mg／kg的186．71U／g FW增加到150mg／kg的666．82U／g FW，增加71．99%；浓度大于150mg／kg酶的活性急剧下降，最低出现在400mg／kg时，与对照相比，降低47．77%。这说明，低浓度Cu2＋处理对酶的活性有一定的促进作用，高浓度Cu2＋处理对酶活性有抑制作用。由于活性氧自由基对该酶活性有一定的刺激作用，因此，这有可能是活性升高的原因。但过高Cu2＋处理时，就会导致自由基大量积累在植物叶片细胞内，造成对植物的过氧化伤害。因为，在延胡索叶片细胞内重金属Cu2＋积累量加大，从而减弱植物叶片细胞内保护酶系统清除活性氧自由基的能力，故，高浓度Cu2＋处理使延胡索SOD活性下降。这与吴国荣、周长芳等的研究结果一致［11］。

2．2．2POD酶活性POD酶和SOD酶同等重要。SOD酶的歧化产物双氧水，被POD酶分解成水。经研究发现，逆境可以减弱POD酶的活性，严重的逆境也可能增强POD的活性，由于逆境诱使植物产生更多的过氧化物。POD活性的高低，不仅与逆境条件有关，还和植物组织受到损害的程度有关，破坏越大，其POD活性越高［6］。由图1可知，Cu2＋处理浓度在0～150mg／kg时，延胡索叶片细胞内的POD活性上升，由对照0mg／kg的406．56U／g FW增至150mg／kg的2 368．06U／g FW，增加82．83%；大于150mg／kg时呈下降趋势，在400mg／kg时，酶的活性最低，与对照相比，降低26．68%。随着Cu2＋处理浓度的进一步增大，可能促进延胡索细胞内氧自由基含量的增加，从而加剧膜脂过氧化，导致大量产生有害物质，降低POD活性，从而对细胞的保护作用减弱，甚至消失。这与王爱云等的研究结果一致［］。

表 不同浓度铜处理延胡索地下块茎的生物量Table Biomass of R．yanhusuo underground tubers under different Cu2＋stress

2．2．3CAT酶活性CAT是H2O2分解为O2和H2O的生物催化剂，能够清除植物体内的H2O2［6］。从图1可知，随着Cu2＋浓度的增加，CAT活性呈先升后降的趋势。由对照0mg／kg的105．78U／（g·min）增至150mg／kg的305．30U／（g·min），增加65．35%；大于1 5 0mg／kg时呈下降趋势，在400mg／kg时，酶的活性最低，与对照相比，降低18．73%。究其原因，由于低浓度Cu2可以促进植株过氧化氢的生成，进而刺激CAT活性升高［13］。当Cu2浓度高于150mg／kg时，CAT活性下降，其原因是过氧化氢过量，破坏了酶系统。此时Cu2污染对植株表现出抑制作用。

图1 不同浓度铜污染延胡索叶片的CAT、SOD 和POD酶活性Fig．1 Leaf CAT，SOD and POD activity of R．yanhusuo under different Cu2＋stress

2．3延胡索叶绿素含量在铜污染下的变化特征

由图2可知，随着Cu2＋处理浓度的增加，除在150mg／kg Cu2＋浓度处理时叶绿素（a＋b）含量略有增加外，整体呈下降趋势。叶绿素含量变化表明，植物在Cu2＋浓度很低时，存在抗逆性，但Cu2＋浓度增大超过植物自身调节范围时，叶绿素含量则迅速减少。这可能是由于Cu2＋大量进入延胡索叶片细胞内加速叶绿素分解，同时导致叶绿体结构破坏［5］。

图2 铜污染下延胡索叶绿素（a＋b）的含量Fig．2 Leaf chlorophyll（a＋b）content of R．yanhusuo under different Cu2＋stress

2．4铜污染对延胡索重金属含量的影响

由图3可知，随着Cu2＋浓度的增加，延胡索地下块茎Cu2＋积累量增加，各处理间差异显著（P＜0．05），并且浓度越大，增长的幅度越大，积累量越大。在Cu2＋浓度为250mg／kg时，Cu2＋含量增加速度最大，达119．03mg／kg，比浓度为150mg／kg时增加95．37%；Cu2＋浓度为400mg／kg时，Cu2＋积累量为129mg／kg，比350mg／kg增加5．31%。生产上应该注意土壤中的Cu2＋含量。

图3 铜污染下延胡索地下块茎中的Cu2＋含量Fig．2 Cu2＋content of R．yanhusuo underground tubers under different Cu2＋stress

3结论与讨论

1）Cu2＋污染明显影响延胡索叶绿素含量和生物量。Cu2＋污染下的延胡索叶绿素含量变化明显，总体呈下降趋势。绿色植物能进行光合作用的主要色素是叶绿素，因此，叶绿素含量的多少，直接影响光合作用的强弱，其含量在一定程度上反映植物同化作用的能力［5，14］。

高浓度的重金属常常会破坏植物叶绿体膜系统，使叶绿体合成受阻，这就有可能是延胡索叶片中叶绿素含量减少的原因。Rebechini H M等认为，叶绿体基粒垛结构的解体，很可能是过量Cu2＋造成的；同时Cu2＋的过量还能使相关基质减少，从而破坏叶绿体结构。其次，高浓度的Cu2＋会破坏延胡索的根系，减弱根系对营养元素的吸收、转移，间接抑制延胡索体内其他元素的含量，从而影响叶绿素的正常合成。此外，Cu2＋在根部积累过多，使得叶绿素前体物质的合成受阻，而且还与叶绿体中蛋白质上的—SH基结合，以此影响叶绿素酸脂还原酶等一系列酶的活性。由于Cu2＋是植物必须的营养元素，这有可能是叶绿素酶活性增加的主要原因，进而分解植物体内的叶绿素，引起延胡索生物量减少。

2）Cu2＋处理对延胡索抗氧化酶活性有明显影响。CAT、POD和SOD活性随着Cu2＋浓度的增加先升后减。植物为了使自身不受伤害，通常情况下，体内都有各种平衡机制，植物体内活性氧代谢也不例外。但是，由于各种外在因素的影响，使植物机能下降，体内机制不再平衡，使得活性氧的量不断上升，超过自身需要的范围，而且加速膜脂过氧化，损害细胞膜系统的功能。重金属胁迫中的SOD、POD 及CAT的作用，已经在很多研究中出现。本试验结果表明：Cu2＋从植物根系进入植物体，在体内转移的过程中，会发生一系列生理生化反应，随之产生过氧化物，随其增加，出现对植物的伤害，从而反馈调节POD酶活性，植物对过氧化物含量以及POD酶活性的调节是一个连环机制。而POD活性下降的原因则是：随着Cu2＋处理浓度的进一步增大，细胞内氧自由基含量超过了植物能调节的范围，使得植物体内膜脂过氧化加剧，间接刺激POD，使其活性下降，从而失去作用，对植物细胞的保护也消失。

SOD是一种超氧自由基清除剂，也是在植物体内调节氧自由基平衡的一种酶，使氧自由基处于平衡状态，对植物不产生伤害。SOD的活性高低受两方面的影响，即体内调节和植物抗性的大小。生物本身存在适应环境的能力，因此在适度逆境诱导下，植物靠体内酶的调节缓冲不良环境，因此，其抗逆能力有所提高。本研究结果显示：在Cu2＋胁迫浓度很小时，延胡索叶片内的活性氧清除酶增加，这是为了适应环境而特有的机制。从而刺激SOD的活性增加，由此可以将叶片中产生的过多O2－在伤害自身前尽快清除。但是再继续增加Cu2＋浓度，植物自身正常歧化能力已经不能消除过多O2－，叶片中过量的O2－就会损害叶细胞多种功能膜和酶系统，从而使SOD酶活性削弱，因此活性出现下降的趋势。

1901年Loew首次在炯草中发现并提取能够催化双氧水分解的酶，命名为Catalase［15］。植物体内CAT的作用是将H2O2催化分解成H2O和O2，位于植物微体和相关细胞器中的CAT是一种蛋白质，其具体性质为单功能、阴聚体的含亚铁血红素，植物叶中光呼吸产生的过氧化氢，就是被其除去的［16］。叶绿体中，H2O2的分解过程，需要催化剂的存在，CAT是该过程的催化剂。本研究结果表明：随着Cu2＋浓度的增加，CAT活性以先增加后减少的趋势变化。由于低浓度Cu2＋对H2O2产生促进作用，在植物体内，营养物质运输过程中，会发生系列生理生化反应，使得CAT活性增加。但随着Cu2＋浓度增加，Cu2＋胁迫对植株表现出抑制作用，植物CAT活性降低。

3）Cu2＋污染能明显增加延胡索地下块茎中的Cu2＋含量，随着Cu2＋浓度的增加，延胡索地下块茎Cu2＋积累量增加。在Cu2＋浓度为250mg／kg土时，Cu2＋含量增加速度最大，达119．03mg／kg，生产上应注意土壤中的Cu2＋含量。

［1］张 华，张学兰．延胡索炮制现代研究［J］．山东中医大学学报，2001（3）：143－144．

［2］田 明，张贵君，马金娟，等．近年来中药延胡索研究简介［J］．中医药学报，1996（3）：39－40．

［3］周荣汉．延胡索的拉丁名［J］．植物分类学报，1977，15 （2）：81．

［4］李廷真，付 川，余顺慧，等．Cu2＋胁迫下三峡库区消落带的狗牙根生长状况及其铜富积效应［J］．贵州农业科学，2013，41（7）：84－186．

［5］余顺慧，来守军，付 川，等．铜胁迫对三峡库区消落带适生植物狗牙根生理特性和铜积累的影响［J］．西南师范大学学报：自然科学版，2013，38（11）：64－69．

［6］余顺慧，黄怡民，潘 杰，等．铜胁迫对2种三峡库区消落带适生植物生长及铜积累的影响［J］．西南农业学报，2014，27（3）：1196－1201．

［7］潘 杰，来守军，黄怡民，等．铅胁迫对2种三峡库区消落带适生植物生长及铅积累的影响［J］．江苏农业科学，2014，42（6）：332－335．

［8］李合生．植物生理生化试验原理和技术［M］．北京：高等教育出版社，2000．

［9］郝建军．植物生理学试验技术［M］．沈阳：辽宁科学技术出版社，2004．

［10］杨居荣，黄 翌．植物对重金属的耐性机理［J］．生态学杂志，1994，13（6）：20－26．

［11］陆长梅，吴国荣，程光宇，等．银杏叶提取物对普通小球藻Hg2＋毒害保护作用的研究［J］．云南环境科学，2000（8）：22－25．

［12］王爱云，黄姗姗，钟国锋，等．铬胁迫对3种草本植物生长及铬积累的影响［J］．环境科学，2012，33（6）：2028－2037．

［13］蒋明义，郭绍川．OH胁迫下稻苗体内脯氨酸积累及其抗氧化作用［J］．科学通报，1997，42（6）：646－649．

［14］王 娟，李德全．水分胁迫下植物体内的抗氧化剂及其作用［J］．生物学通报，2002，37（10）：22－23．

［15］Loew O．Catalase：A New Enzyme of General Occurrence［M］．Washington DC：Government Printing Office，1901，68：1－47．

［16］Willekens H，Inze D，Van Montagu M．Catalases in plants［J］．Molecular Breeding，1995，1：207－208．

（责任编辑：刘 海）

Effects of Copper Pollution on Growth and Cu2＋Accumulation of Rhizoma yanhusuo

YU Shunhui，LIU Shuanglin，FANG Rongmei，DONG Kaixin，ZHANG Jing，QI Junsheng＊
（Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservoir，Wanzhou，Chongqing404100，China）

R．yanhusuo plants were cultured in pots adding different Cu2＋concentration to discuss effects of heavy metals on growth，antioxidant enzyme activity and Cu2＋accumulation of R．yanhusuo under different Cu2＋stress and expound the toxicant mechanism of Cu2＋pollution to R．yanhusuo．Results：Cu2＋pollution inhibits growth of R．yanhusuo．The CAT，POD and SOD activity of R．yanhusuo presents a first rising and then declining trend with increase of Cu2＋concentration．The leaf chlorophyll content of R．yanhusuo shows a declining trend overall with increase of Cu2＋concentration，except for 150mg／kg Cu2＋concentration．Cu2＋accumulation in R．yanhusuo underground tubers increases gradually with increase of Cu2＋concentration and the increase speed of Cu2＋content in R．yanhusuo underground tubers reaches the maximum when Cu2＋concentration is 250mg／kg，which indicates that soil Cu2＋content should be paid more attention to in production of R．yanhusuo．

copper pollution；Rhizoma yanhusuo；growth；Cu2＋accumulation

S19

A

1001－3601（2016）02－0083－0133－04

2015－07－07；2015－12－30修回

重庆市应用开发计划项目“延胡索规范化生态种植与深加工关键技术研发”（cstc2014yykfA110024）

余顺慧（1964－），女，教授，硕士，从事植物生态学研究。E－mail：ysh＿dch＠163．com

＊通讯作者：祁俊生（1964－），男，教授，博士，从事植物生态学研究。E－mail：qijunsheng＠163．com