金线莲组培快繁条件的优化

肖小君，王曼丁，曾桢迦，唐正义＊

（1．内江师范学院生命科学学院，四川内江641100；2．成都市树德中学（光华校区），四川成都610031）

金线莲组培快繁条件的优化

肖小君1，王曼丁2，曾桢迦1，唐正义1＊

（1．内江师范学院生命科学学院，四川内江641100；2．成都市树德中学（光华校区），四川成都610031）

为优化金线莲快繁技术体系以批量生产金线莲，以其无菌苗为外植体，MS为基本培养基，附加不同浓度的植物激素（6－BA，NAA，IBA）、蔗糖及活性炭等研究金线莲不定芽增殖、生根的影响，并进行移栽试验。结果表明：金线莲不定芽增殖培养以MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L的效果较佳，生根培养以1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L的效果较好，较适移栽基质为珍珠岩∶泥炭土∶松树皮＝1∶1∶1，成活率达98%。

金线莲；组织培养；快速繁殖

金线莲（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属多年生草本植物，多生长在海拔500～1 600m的阴湿森林或竹林内［1］。其株型小，叶形优美，叶脉金黄色呈网状，除具有很高的观赏价值外，还有药王、金草、神药、乌人参等美称，可全草入药，是名贵珍稀的中草药［2］，具有广阔的开发利用前景。

金线莲的种子发育不全，由于其对生态环境要求严格，在野生自然条件下萌发率和繁殖率都极低［3］，加之近年来，野生资源不断遭到破坏性采挖，以致处于濒临灭绝之地［4］。随着药效学和临床应用对金线莲研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，导致金线莲的市场需求压力增大。目前，虽然金线莲的组培快繁技术在各个环节的研究已有报道［5－8］，但不同基因型植物其繁殖体系还不稳定，工厂化、规模化的生产技术还有待进一步研究。因此，笔者结合当地公司产业化生产需要，以无菌苗为试材，应用正交设计试验着重研究植物生长调节剂及蔗糖浓度对不定芽增殖与生根的影响，优化金线莲组织培养快繁条件，旨在为金线莲组培苗的工业化生产提供技术参考。

1材料与方法

1．1材料

选用长势一致的金线莲无菌植株作为试验材料，由内江师范学院生命科学学院植物组培室提供。

1．2不定芽增殖培养的激素浓度筛选

以MS作为基础培养基，采用3因素3水平正交设计试验方案L9（33）（表1），选取生长健壮，大小一致的金线莲不定芽接入9种培养基中，每种培养基均加入琼脂粉5．5g／L，pH 5．8左右，其中每个配方接种6瓶，每瓶接种6株不定芽。培养条件：温度白天（23±2）℃、夜间（20±2）℃，光照时间14 h／d，光照强度2 000lx，室内通气条件良好。每周观察不定芽的增殖情况，40d后观察并统计增殖后总芽数、增殖倍数及不定芽生长情况。

表1 金线莲不定芽增殖正交试验设计L9（33）Table 1 Orthogonal test L9（33）of A．roxburghii adventitious buds proliferation

1．3生根诱导培养

一般低浓度的无机营养成分有利于组培苗的根诱导［7］。在前期试验的基础上，设置6种生根培养基进行优化筛选。以1／2MS为基本培养基，选取长2～3cm，有2～3片叶的丛生芽，切割成单芽，接种到添加不同浓度IBA和NAA生根诱导培养基中（表2），每个处理接种6瓶，每瓶接种6株单芽，40d后统计生根情况。接种方法和培养条件与1．2相同。

表2 金线莲不定芽生根培养的配方设计Table 2 Component design of A．roxburghii adventitious buds rooting

1．4炼苗移栽

金线莲移栽基质要求疏松、透气、排水性能良好。选择以下3种基质进行试验：1）珍珠岩∶泥炭土∶松树皮＝1∶1∶1；2）珍珠岩∶泥炭土＝1∶1；3）泥炭土∶松树皮＝1∶1。具体操作为待生根后的组培苗生长到3～5cm，有2～5片叶时，将培养瓶移到室外打开瓶盖练苗3～5d，然后洗去小苗基部的残留培养基，移入预先消毒过的珍珠岩、泥炭土、松树皮的3种基质中，每天叶片喷雾1次，保持环境相对湿度在80%～90%，并加强栽培管理，经过4周的生长培养后，观察其生长情况。

2结果与分析

2．1不同浓度激素配比金线莲的不定芽增殖

接种1周后，1号、4号、5号、6号、7号培养基开始出现萌动的现象，茎节开始膨大，腋芽发白，生长状况良好；3号、8号、9号培养基萌动现象不明显。接种15～20d后，4号、6号、7号、9号培养基增殖效果明显，植株周围产生少量肉眼可见的突起，腋芽开始分化可观察到乳白色的不定芽，少数茎段表面形成白色绒毛；30d后，可见明显的丛生芽，芽体嫩绿；35d后，丛生芽继续生长，但不继续产生新的不定芽。

由表3可知：不同激素浓度配比对金线莲丛生芽增殖的影响差异显著。在选择的3个因子中，随6－BA浓度的上升，增殖后不定芽总数逐渐增加，且3个水平差异显著；随NAA浓度的上升，不定芽总数呈先下降后上升的趋势；随蔗糖浓度的上升，不定芽总数反而呈下降趋势，且3个水平差异较大。

不同试验因子对不定芽继代培养增殖倍数影响的极差R（表4）顺序：NAA＞6－BA＞蔗糖。适量浓度的NAA有利于不定芽萌发增殖，并有利于芽体萌发后的生长健壮，以0．5mg／L最佳。从试验结果综合考虑，配方6（MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L）对金线莲不定芽增殖效果较佳，此时芽增殖倍数最高，达7．08，且表现为叶缘光滑，叶表面为黑紫色，金色叶脉明显，苗高茎粗，长势较好。

表3 不同激素配比处理金线莲的不定芽增殖情况Table 3 Proliferation of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

表4 不同激素配比处理金线莲不定芽增殖的极差Table 4 Range of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

2．2不同浓度激素金线莲试管苗的生根

金线莲根的生长比较缓慢，培养12～20d开始萌发生长。由表5可知，1号、2号、3号培养基的生根效果不理想，生根率低，根的质量比较细弱，平均根长较短。通过分析可知，单一的生长素对根的诱导培养效果不显著。从生根率、平均生根数、平均根长方面综合考虑，5号培养基（1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L）处理的生根效果最好，生根率达96%，平均生根数为2．89条。说明，NAA与IBA的配合使用有利于金线莲不定芽生根。

表5 不同浓度激素处理金线莲不定芽的生根Table 5 Rooting of A．roxburghii adventitious buds in different concentrations hormone

2．3炼苗移栽

从表6可知，在珍珠岩∶泥炭土∶松树皮＝1∶1∶1混配的基质中移栽成活率最高，达98%，生长状况最好，植株质量粗壮，叶正常舒展。珍珠岩密质适中，疏松透气，不易板结，排水能力良好，树皮经发酵处理，不易长菌，且保水保肥，可能是其移栽成活率高、长势好的原因。而在其他2种基质中金线莲移栽的成活率则较低，2号基质的成活率为76%，3号基质的成活率为88%，植株生长较缓慢，植株瘦小，叶微卷曲。

表6 不同基质金线莲组培苗移栽的成活率Table 6 Transplanting survival rate of A．roxburghii seedlings in different matrix

3结论与讨论

影响金线莲试管苗生长发育的因素比较多。如基本培养基、激素成分及含量、pH、光照、温度等。其中，激素的种类、含量及比例是最关键的因素。如MS＋6－BA 3．5mg／L＋KT 1．5mg／L＋NAA 0．6 mg／L组合是芽快速增殖的最佳配方，3种激素对芽继代增殖系数影响大小为6－BA＞NAA＞KT［8－11］。何碧珠［9］通过试验得出：1／2MS＋BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋KT 1．0mg／L＋香蕉汁100g／L＋AC 0．2%配方为金线莲芽增殖的最适激素组合。分析认为，香蕉汁中含有大量的糖类和植物激素，如生长素、细胞分裂素、乙烯和赤霉素，可为植物组织细胞分裂分化提供能量。研究采用正交试验设计方案优化的最佳增殖配方为MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L，试管苗长势健壮，叶片伸展。

IBA和NAA在一定的浓度配比下能促进植物的快速生长，促使茎的伸长，促进植物生根和有效减缓根的老化［12］。适宜浓度的NAA与IBA的激素配比对金线莲根的诱导效果较好。陈兆贵［10］认为，在生根培养过程中加入一定量的活性炭和水解酪蛋白有利于提高生根率。本试验结果表明，1／2MS＋IBA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L效果最理想，生根率最高，根的质量最好。

25%粗松树皮＋75%进口泥炭土为台湾金线莲生长的最优栽培基质［13］。本试验在此基础上加入珍珠岩，且三者之间的比例为1∶1∶1时可使成活率达98%，且幼苗长势旺盛。分析认为，珍珠岩有疏松透气、不易使土壤板结的功效，有利于金线莲幼苗根的透气生长。同时本研究表明，在移栽过程中要注意基质和幼苗本身的消毒，金线莲移栽前期阶段，影响其成活率的重要因素是保证充足的水分。移栽的试管苗根较少，叶片较多时容易发生萎焉，分析可能与其蒸腾作用有关［14］。

［1］魏翠华，谢 宇，陈 沁，等．台湾金线莲增殖培养正交试验设计［J］．亚热带植物科学，2012，41（4）：57－59．

［2］黄小凤，周志东，杨 成，等．珍稀药用植物金线莲及其栽培技术［J］．广东农业科学，2005（5）：80－81．

［3］罗安雄，孟志霞，陈晓梅，等．福建金线莲种子萌发及幼苗培养研究［J］．中国药学杂志，2012（15）：11－13．

［4］高 燕，白燕冰，赵云翔．金线莲组织培养几种培养基的筛选［J］．热带农业科技，2004，27（3）：12－14．

［5］魏翠华，秦建彬，谢 宇，等．应用正交设计法优选台湾金线莲快繁培养基［J］．中国农学通报，2013，29（4）：114－117．

［6］李艳冬，叶红霞，陈丽萍．金线连组培快繁技术体系的研究［J］．江西农业学报，2013，25（4）：52－54．

［7］李丹丹，张付远．金线莲茎尖的组培快繁技术研究［J］．中国科技信息，2011，21（2）：19．

［8］王雅英，林荣耀，杨忠耿，等．金线莲快速繁殖及促根壮苗试验［J］．亚热带植物科学，2005，34（3）：40－42．

［9］何碧珠，何官榕，黄铭星，等．福建野生金线莲快速繁育技术［J］．农业工程，2013，3（2）：72－76．

［10］陈兆贵．金线莲组织培养和移栽技术研究［J］．惠州学院学报，2007，27（6）：14－17．

［11］周玉美，陈 丽，崔永一，等．台湾金线莲（Anoectochilus formosanus）快繁体系的构建［J］．东北林业大学学报，2009，37（12）：43－47．

［12］岑秀芬，韦鹏霄，刘 芳．植物生长调节剂对台湾金线莲试管苗增殖和生根的影响［J］．广西农学报，2009，24（2）：19－21．

［13］谢 静，谭嘉娜，杨俊贤，等．不同栽培基质对金线莲生长和生物产量的影响［J］．广东农业科学，2014 （20）：33－36．

［14］马以忠，邓琳琼，黄丽华．金线莲的研究现状及展望［J］．贵州科学，2006，25（2）：81－84．

（责任编辑：刘忠丽）

Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation of Anoectochilus roxburghii

XIAO Xiaojun1，WANG Manding2，ZENG Zhenjia1，TANG Zhengyi1＊
（1．School of Life Science，Neijiang Normal University，Neijiang，Sichuan641100；2．Guanghua Campus of Chengdu Shude High School，Chengdu，Sichuan610031，China）

To optimize the technical architecture of rapid propagation of A．roxburghii，the effects on proliferation and rooting of adventitious buds were studied by adding different concentrations of plant hormones（6－BA，NAA，IBA），sucrose and charcoal，while using the aseptic seedlings as explants and MS as the basic medium，then the experiment of transplanting was conducted．The results showed that the optimum culture medium for adventitious buds proliferation was MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋sucrose 40g／L，while 1／2MS＋IBA0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋AC 0．2g／L was better for rooting．The optimum transplanting matrix was perlite∶peat∶bark＝1∶1∶1，and the survival rate was 98%．

Anoectochilus roxburghii；tissue culture；rapid propagation

S688．2

A

1001－3601（2016）02－0053－0012－03

2015－09－09；2016－01－07修回

四川省教育厅科研创新团队“川西珍稀植物资源保护与利用”（14TD0025）

肖小君（1982－），女，硕士，助理研究员，从事经济植物组织培养研究工作。E－mail：qianqianxxj＠126．com

＊通讯作者：唐正义（1957－），男，教授，从事遗传毒理的研究。E－mail：tangzy9513＠163．com