青天葵DXR基因编码蛋白的生物信息学分析

黄琼林，何 瑞，詹若挺

（1．广东医学院，广东湛江524023；2．广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州510006；3．岭南中药资源教育部重点实验室，广东广州510006）

青天葵DXR基因编码蛋白的生物信息学分析

黄琼林1，何 瑞2，3＊，詹若挺2，3

（1．广东医学院，广东湛江524023；2．广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州510006；3．岭南中药资源教育部重点实验室，广东广州510006）

为后期青天葵DXR基因的全长克隆、功能鉴定和调控研究奠定基础，采用生物信息学方法对前期通过转录组测序获得的青天葵DXR基因编码蛋白序列进行分析。结果表明：NfDXR序列包含457个氨基酸，分子量约为49．72Ku，为亲水性、混合结构型蛋白质。NfDXR属于1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶超级家族，含有DXR功能域、2个NAPDH结合基序和2个DXR活性位点基序，不具有跨膜结构域和信号肽结构。NfDXR与其他单子叶植物DXR同源性高，其中与铁皮石斛DXR的序列相似度达90%。

1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶；青天葵；生物信息学

1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase，DXR）是植物萜类生物合成途径——MEP途径的关键酶基因之一［1］。研究发现［2－3］，过表达DXR基因可以提高植物萜类化合物的含量，表明DXR基因是调控萜类生物合成的有效靶点。目前，DXR基因已经从阳春砂［4］、高良姜［5］、秦艽［6］、雷公藤［7］、滇龙胆［8］等药用植物中成功克隆。

岭南地区名贵中药青天葵为兰科多年生草木植物毛唇芋兰（Nervilia fordii（Hance）Schltr．）的全株或叶片，在临床上常用于治疗小儿呼吸道和肺部疾病［9］。目前，青天葵野生资源已经基本枯竭，而人工栽培青天葵由于面临萌发条件苛刻、种苗稀缺等瓶颈问题，无法生产足够的青天葵满足临床和市场需求。青天葵植物研究表明，萜类成分是青天葵的主要有效成分之一［10－11］。在化学成分比较明确的情况下，利用植物基因工程技术调控DXR等萜类生物合成功能基因的表达，从而提高青天葵萜类有效成分的含量，进而在整体上提高青天葵药效，是当前缓解青天葵资源紧缺的途径之一。

在前期研究中，广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心课题组完成了青天葵全转录组RNA－seq测序，共获得142 220条青天葵功能基因，其中包括1条长度为1 731bp的青天葵DXR基因cDNA序列［12］。本研究采用生物信息学方法对DXR基因编码的氨基酸进行理化特征、保守功能域、跨膜结构域、信号肽结构、二级结构组成等分析，明确青天葵DXR基因的分子功能和特点，为后续青天葵DXR基因全长的克隆以及利用其促进青天葵萜类有效成分的积累奠定基础。

1材料与方法

1．1DXR氨基酸序列来源

将在青天葵转录组数据中获得的DXR基因序列，翻译成氨基酸序列，并结合青天葵的拉丁名，命名为NfDXR。另外，在Genbank数据库下载铁皮石斛、阳春砂、高良姜等植物DXR氨基酸序列，用于DXR序列多重比对和系统发育分析。

1．2生物信息学分析

采用表中的在线或离线软件对NfDXR进行理化特征、保守功能域、二级结构、三级结构以及系统发育分析等生物信息学分析。

表NfDXR生物信息学分析所用的主要软件Table Bioinformatics software used in this study

2结果与分析

2．1NfDXR的理化特征

ExPASY ProtParam在线工具分析表明，NfDXR包含457个氨基酸，相对分子量为49．72Ku，等电点为6．22。脂溶性指数为98．01，总平均亲水性指数为－0．024。ExPASY Protscale分析结果显示，NfDXR无明显疏水区域，多肽链整体呈亲水性，为亲水性蛋白。

2．2NfDXR的保守功能域

如图1所示，NfDXR在63～191、205～288和320～443位氨基酸分别存在DXP＿reductoisom、DXP＿redisom＿C和DXPR＿C等3个特异性保守功能域，归属于1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶超级家族；NfDXR在13～457位氨基酸间具有1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶（1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase）功能域，说明其具有1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶的功能。

图1 NfDXR的保守功能域Fig．1 Conserved domain of NfDXR

图2 NfDXR的跨膜结构域Fig．2 Putative transmembrane region of NfDXR

2．3NfDXR的跨膜结构域及信号肽

如图2所示，NfDXR整体多肽链不含跨膜结构域，均位于细胞膜外。SignalP分析结果也发现，NfDXR不含信号肽结构。由此推测，NfDXR是不与膜脂结合的非分泌性蛋白。

2．4NfDXR的二级结构

SOPMA分析结果（图3）表明，NfDXR的二级结构由α－螺旋、延伸链、β－转角和不规则盘绕构成，其中α－螺旋和不规则盘绕是主要的组成元件，在多肽链中分布比较集中，而另外2种元件延伸链和β－转角则分布情况相对分散。因此，从整体二级结构来看，NfDXR属于混合结构型蛋白质。

图3 NfDXR的二级结构Fig．3 Secondary structure prediction of NfDXR

2．5NfDXR的多重序列比对

NfDXR与其他植物DXR的氨基酸序列多重比对（图4）显示，不同DXR在70位氨基酸后的序列具有较高的连续相似性，说明DXR在不同植物中存在序列和功能的高度保守性。其中，在其N－端含有2个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）结合基序GSTGSIGT和LAAGANV，在多肽链中部含有2个DXR活性位点基序PADSEHSA和NKGLEVIEAHY。

图4 不同植物DXR氨基酸序列的多重比对Fig．4 Multiple alignment of DXR sequences from various plants

2．6系统发育树

10种不同植物DXR蛋白的系统发育树如图5所示，青天葵、铁皮石斛、高良姜、阳春砂等单子叶植物来源DXR聚集在一起，其中NfDXR与同为兰科的铁皮石斛DXR同源性最高，序列相似度可达90%；而拟南芥等双子叶植物来源DXR则聚成另外一个分支。

图5 不同DXR的系统发育树Fig．5 Phylogenetic tree of different DXRs

图6 NfDXR的三级结构Fig．6 Tertiary structure prediction of NfDXR

2．7NfDXR的三级结构

Swiss－model三级结构预测（图6）显示，NfDXR的功能结构域在空间结构上折叠成V形，V形的两臂由N端与C端构成。N端臂内含有2个NADPH结合基序；V形的底部，即N端臂与C端臂结合域内藏有2个DXR活性位点基序。

3结论与讨论

DXR作为植物萜类生物合成MEP途径的第2个酶，将DXP催化生成MEP这一萜类合成重要前体，由于DXR也是硫胺素（VB1）和吡哆醇（VB6）生物合成的前体物质。因此，DXR主导的催化反应是MEP途径的碳流分支点，DXR也被认为是MEP途径的关键酶之一。Mahmoud等［2］在胡椒薄荷中过量表达DXR基因，可促进叶片中薄荷油等单萜的合成，使薄荷精油量提高50%。Wu等［3］从丹参发根中克隆得到DXR基因，发现其表达量与高渗透压和酵母真菌激发子呈正相关，并与二萜类成分丹参酮的积累相关。DXR突变还影响植物叶绿素、赤霉素和脱落酸等物质的合成，导致植株出现白化、矮化等异常表型［13］。因此，DXR不仅是植物萜类生物合成的重要调控靶点，还对植物的生长发育有重要的影响。

本研究在青天葵转录组高通量测序数据的基础上，采用生物信息学方法对青天葵1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶进行理化特征及分子功能研究得出，NfDXR以α－螺旋和不规则盘绕为主要二级结构组成元件的亲水性、非膜脂结合、非分泌性蛋白。NfDXR具有1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase功能域，归属于1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶超级家族。多重序列比对、系统发育树分析和三级结构预测也表明，NfDXR与其他植物DXR蛋白存在高度的同源性，氨基酸序列中均含有共有的结合域（2个NADPH结合基序和2 个DXR活性位点基序），提示NfDXR具有与其他植物DXR类似的功能，即催化前体DXP发生分子重排并在NADPH和二价金属离子参与下还原生成MEP。

［1］Takahashi S，Kuzuyama T，Watanabe H，et al．1－deoxy－D－xylubose－5－phosphate reductoisomerase catalyzing formation of 2－C－Methyl－D－erythritol－4phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for treenpenoid biosynthesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）：9879－9884．

［2］Mahmoud S S，Croteau R B．Metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reducoisomerase and menthofuran synthase［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（15）：8915－8920．

［3］Wu S J，Shi M，Wu J Y．Cloning and characterization of 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase gene for diterpenoid tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza（Chinese sage）hairy roots［J］．Biotechnol Appl Biochem，2009，52（Pt1）：89－95．

［4］杨锦芬，阿迪卡利，陈蔚文，等．阳春砂葵1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶基因的克隆及表达分析［J］．广州中医药大学学报，2010，27（5）：510－516．

［5］张春荣，杨 全，陈虎彪，等．高良姜葵1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶cDNA克隆和表达调控［J］．中国中药杂志，2012，37（21）：3208－3214．

［6］祝传书，陈 欣，郭 嘉，等．雷公藤1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶基因（TwDXR）的克隆与表达分析［J］．农业生物技术学报，2014，22（3）：298－308．

［7］化文平，岑 文，孔维维．秦艽5－磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因（GmDXR）的克隆和表达分析［J］．中草药，2014，45（12）：1758－1763．

［8］张晓东，赵 静，李彩霞，等．滇龙胆葵1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析和原核表达［J］．中草药，2014，45（16）：2378－2784．

［9］陈蔚文．岭南本草（二）［M］．广州：广东科技出版社，2010：326－351．

［10］梅全喜．青天葵的化学成分药理作用与临床应用研究进展［J］．中华中医药学刊，2008，26（10）：2239－2241．

［11］邱 莉，徐灵源，缪建华，等．青天葵植物化学成分和药理活性研究进展［J］．时珍国医国药，2011，22（9）：2258－2260．

［12］Huang Q，Liang L，He R，et al．The first insight into transcriptome profile of herbaceous plant Nervilia fordii based on RNA－seq［J］．Plant Omics，2015，8（6）：493－499．

［13］Xing S，Miao J，Li S，et al．Disruption of the 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase（DXR）gene results in albino，dwarf and defects in trichome initiation and stomata closure in Arabidopsis［J］．Cell Res，2010，20（6）：688－700．

（责任编辑：刘忠丽）

Bioinformatics Analysis of Gene DXRfrom Nervilia fordii

HUANG Qionglin1，HE Rui2，3＊，ZHAN Ruoting2，3
（1．Guangdong Medical University，Zhanjiang，Guangdong524023；2．Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006；3．Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Ministry of Education，Guangzhou，Guangdong510006，China）

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase is one of the rate－limiting key enzymes of plant MEP terpenoids biosynthesis pathway．Enhancing DXR expression could promote the synthesis of terpenoid．In order to lay the foundation for overall length coloning，functional identification and regulation of gene DXRfrom N．fordii，in later period，bioinformatics methods were employed to analyze DXR protein sequence acquired from N．fordii transcriptome data．Results：NfDXR，containing 457 amino acids，was a hydrophilic and structurally hybrid protein with a molecular weight at 49．72Ku．NfDXR contained a 1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase functional domain，two NAPDH binding motifs，two DXR active motifs and none signal peptide and transmembrane region．NfDXR shared high homology with othrer DXR from monocotyledons，in which the similarity with DXR from Dendrobiumofficinalereached 90%．

1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate reductoisomerase；Nervilia fordii；bioinformatics analysis

S567．23＋9

A

1001－3601（2016）02－0082－0129－04

2015－07－10；2016－01－10修回

国家自然科学基金项目“中药青天葵分枝发育相关基因的研究”（30701090）；广东省自然科学基金博士启动项目“中药青天葵黄酮类生物合成途径关键酶基因CHS和FLS的功能和调控研究”（2015A030310519）

黄琼林（1986－），男，讲师，博士，从事医学生物化学研究。E－mail：perfecthql＠163．com

＊通讯作者：何 瑞（1972－），女，研究员，博士，从事中药资源可持续利用研究。E－mail：ruihe＠gzucm．edu．cn