核苷功能菌的生物学特性研究

周新虎，陈　翔，杨　勇，李　喆，严启梅，甘广东，宋　宝，谭洪弟（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）



核苷功能菌的生物学特性研究

周新虎，陈翔，杨勇，李喆，严启梅，甘广东，宋宝，谭洪弟
（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

摘要：为了深入研究微分子酒中核苷类似物的形成机理，对洋河酿造环境中筛选的核苷功能菌的生物学特性进行研究。通过对核苷功能菌的形态、代谢产物和培养条件进行分析和研究。结果表明，核苷功能菌属于麦角菌科真菌，能够代谢生成多糖、腺苷和D-甘露醇等；适宜的生长温度范围为18～25℃，其中22℃最佳；适宜的pH值范围为5～7，最适pH值为5；能利用多种碳源、氮源和无机盐；碳源中，二糖的利用效果更好，其中蔗糖最佳；氮源中，有机氮源能更好地被利用，其中酵母膏最佳；无机盐中Na2HPO4最佳。

关键词：核苷；生物学特性；代谢；培养条件

随着生活水平的提高和健康意识的增强，对健康的诉求已成为中国白酒未来的发展方向和路径之一。当前一些传统老品牌白酒度数高，酒量较小者喝了之后容易上头，导致一些爱酒人士只能望酒兴叹。正是在这种情况下，洋河酒厂根据白酒市场不断发展变化的需求，在充分掌握绵柔机理的基础上，结合最新研究的微分子技术，研制成功一款健康白酒——微分子酒。

微分子酒是由微量小分子风味组分，以及富含核苷类似物为主的生物活性健康物质构成的绵柔型白酒，具有微量成分多、饮后醒酒快、健康功效好、尽兴更省心的特点。自上市以来，已逐渐受到市场认可和消费者青睐，并引发行业更多关于“健康生态”的思考和效仿。据相关研究，微分子酒中的核苷类物质有助于保肝护肝、提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等功效，具有良好的保健功能，有极高的开发前景[1-2]。本研究以酿造环境中筛选的能够产核苷类似物的1株功能菌为研究对象，通过对其生物学特性进行深入研究，为其深度应用提供基础。

1　材料和方法

1.1材料、试剂及仪器

实验菌株：洋河酒厂自主筛选的1株核苷功能菌。葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、饴糖、乳糖、NH4NO3、（NH4）2SO4、NaCl、MgSO4、MnSO4、FeSO4、KH2PO4、KCl、Na2HPO4、CaCl2为分析纯；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、琼脂为生化试剂；马铃薯为食品级。

仪器设备：BILON恒温培养箱，生物洁净工作台，真空冷冻干燥器，离心机，高压蒸汽灭菌锅，多功能环境模拟箱，可见分光光度计。

1.2实验方法

1.2.1培养基[3]

马铃薯（PDA）液体培养基：土豆汁1 L、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、pH值自然。

马铃薯琼脂（PDA）培养基：土豆汁1 L、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g、pH值自然。

液体基础培养基：蔗糖4％，蛋白胨1％，KH2PO40.01％，MgSO40.05％。

1.2.2培养基成分筛选[4-5]

在液体基础培养基中，分别以其他碳源、氮源和无机盐进行替代，研究其他成分对核苷功能菌的影响。其中其他碳源为单糖（葡萄糖）、二糖（麦芽糖、乳糖）、土豆汁、饴糖；其他氮源为无机氮源（NH4NO3、（NH4）2SO4）、有机氮源（酵母膏、牛肉膏）；其他无机盐为NaCl、MnSO4、FeSO4、KCl、Na2HPO4、CaCl2。

分别取供试培养基200 mL，装入500 mL的三角瓶中，灭菌后在无菌条件下，以10％的接种量接入液体菌种，置于振荡培养箱中，在25℃、120 r/min下振荡培养5 d后终止培养，每组设2个重复。

1.2.3生物量测定方法

取200 mL发酵液，经4000 r/min离心10 min，收集菌丝体，再置于真空冷冻干燥箱-50℃冷冻干燥直至恒重，称重。按下列公式计算菌丝体生物量：

菌丝体生物量(g/L)=菌丝体干重(g) /发酵液体积(L)。

1.2.4温度对核苷功能菌的影响[6]

采用不同温度（10℃、15℃、18℃、22℃、25℃、28℃）进行核苷功能菌的培养，培养结束后收集菌丝体，测其生物量。

1.2.5初始pH值对蛹虫草生长速度的影响

采用不同初始pH值（3、4、5、6、7、8）进行核苷功能菌的培养，培养结束后收集菌丝体，测其生物量。

1.2.6代谢产物分析

多糖，苯酚硫酸法[7-9]；D-甘露醇，比色法[10]；腺苷，液相色谱法[11]。

2　结果与分析

2.1核苷功能菌形态特征及代谢产物

2.1.1核苷功能菌菌落和菌丝的形态特征

采用PDA固体培养基，于25℃下对核苷功能菌进行暗室培养，观察菌落形态，并进行显微镜观察。核苷功能菌菌落形态及镜检情况见图1。由图1可知，核苷功能菌在PDA培养基上形成的菌落呈近似圆形，表面蓬松，凸起呈棉絮状的半球形，菌丝为白色，气生菌丝发达，边缘整齐，较易挑取。对核苷功能菌进行显微镜观察，发现分生孢子为圆形或圆柱形，其外形大小为2.5～3.2 μm× 4.0～6.8 μm；分生孢子着生在孢子梗的顶端，或成单，或成对，或成簇排列；分生抱子梗单生或有分枝。菌丝有隔膜，粗细均匀，但老龄菌丝内会形成空泡。

图1　核苷功能菌菌落形态和菌丝镜检情况

2.1.2核苷功能菌生长条件

采用PDA固体培养基，在智能人工气候培养箱中调控不同培养温度、湿度条件对核苷功能菌进行培养，观察菌丝生长情况得出最适生长范围，结果见表1。

表1　核苷功能菌培养条件

如表1所示，核苷功能菌在6～30℃范围内都能够生长，否则停止生长甚至死亡，适宜温度为18～25℃；在相对湿度处于65％～70％时，菌丝体生长状况最好，过小会造成培养基内部失水干枯，过大则影响菌丝体的生长，也易引起杂菌滋生。

2.1.3核苷功能菌代谢产物分析

采用PDA液体培养基，以120 r/min、25℃恒温培养核苷功能菌，5 d后收集菌丝体，并分析其代谢产物及其含量，结果见表2。

表2　核苷功能菌代谢产物分析

如表2所示，核苷功能菌在PDA液体培养基中能够代谢生成多糖、腺苷和D-甘露醇等，通过对菌丝体进行检测与分析，生物量达到7.58 g/L，多糖为1.64％，腺苷为188.5mg/100 g，D-甘露醇为5.52％。

依据核苷功能菌的菌落和菌丝形态和生长特性，结合代谢产物分析，初步认为该核苷功能菌属于麦角菌科真菌，有较高的利用价值和开发前景。

2.2不同培养条件对核苷功能菌的影响

2.2.1碳源对核苷功能菌生长的影响

碳源是微生物合成碳水化合物及氨基酸的基础，核苷功能菌对不同碳源的利用及代谢情况不同。分别以葡萄糖、饴糖、麦芽糖、乳糖、土豆汁代替液体基础培养基中的蔗糖，培养结束后测其生物量，结果见图2。

图2　碳源对核苷功能菌生物量的影响

由图2可知，核苷功能菌在添加6种碳源的培养基中均能生长，说明其可以利用多种碳源，但不同碳源对菌丝生长的影响不同。从生物量上看，以蔗糖为碳源最有利于菌丝体生长，其次是饴糖、麦芽糖和乳糖，再次是葡萄糖，而土豆汁最低。由此可知，核苷功能菌能更好的利用二糖，因此，蔗糖是核苷功能菌生长的最佳碳源。

2.2.2氮源对核苷功能菌生长的影响

氮源对于微生物生长与代谢影响很大，分别以无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）和有机氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨）代替液体基础培养基中的蛋白胨，培养结束后测其生物量，结果见图3。

图3　氮源对核苷功能菌生物量的影响

由图3可知，核苷功能菌在添加5种氮源的培养基中均能生长，说明其可以利用多种氮源。就生物量而言，除蛋白胨外，添加有机氮源的培养基中得到的生物量明显高于采用无机氮源，甚至是无机氮源的2倍。说明无机氮源虽然能够更快的被微生物利用，但核苷功能菌生长速度慢，而且有机氮源中有着丰富的蛋白质，更适合核苷功能菌菌丝体的生长需求。在有机氮源中，牛肉膏和酵母膏都能较好地满足核苷功能菌的生长所需，因此，牛肉膏或酵母膏均是核苷功能菌生长的最佳氮源。

2.2.3无机盐对核苷功能菌生长的影响

无机盐种类对微生物代谢以及信息传导具有重要作用。分别以不同无机盐代替液体基础培养基中的KH2PO4、MgSO4，培养结束后，测其生物量，结果见图4。

由图4可知，核苷功能菌在各种无机盐的培养基中都能生长。MgSO4和KH2PO4单独作为无机盐加入培养基中时，生物量较基础液体培养基低；但核苷功能菌在添加Na2HPO4的培养基中生物量最高，达10.84 g/L，较基础培养基中的生物量高2 g/L左右；添加其余各种无机盐的生物量都较基础培养基低。因此，Na2HPO4为核苷功能菌菌丝体生长的最佳无机盐。

图4　无机盐对核苷功能菌生物量的影响

2.2.4温度对核苷功能菌菌丝体生长的影响

以蔗糖为碳源、酵母膏为氮源，Na2HPO4为无机盐配制培养基，接种核苷功能菌于不同温度（10℃、15℃、18℃、22℃、25℃、28℃）下振荡培养，培养结束后测其生物量，结果见图5。

图5　温度对核苷功能菌生物量的影响

由图5可知，核苷功能菌在10～28℃下均能生长，但不同温度下核苷功能菌菌丝体生长情况存在差异。低于18℃，核苷功能菌生长速率慢，生物量低；在18～25℃时，核苷功能菌生长良好，其中生物量在22℃时达到最大，为19.57 g/L；高于25℃时，生物量快速下降。由此可知，核苷功能菌不耐高温，在低温下也能生长，其生长适宜温度为18～25℃，最适温度为22℃，低于18℃或高于25℃都不利于核苷功能菌生长，其中高于25℃对其生长有明显抑制作用。

2.2.5不同初始pH值对核苷功能菌生长的影响

以蔗糖为碳源、酵母膏为氮源，Na2HPO4为无机盐配制培养基，调节不同初始pH值，接种核苷功能菌进行恒温振荡培养，培养结束后收集菌丝体，测生物量。所得结果见图6。

图6　不同初始pH值对核苷功能菌菌丝体生长影响

由图6可知，核苷功能菌在pH 3～8范围内均能生长，但生长情况有明显差异。在pH 5～7范围内，生物量较高且较稳定；pH值低于5时，生物量随pH值升高而缓慢增加；pH值高于7时，生物量随pH值的升高而缓慢减少；生物量在pH 5时达最大值。由此可知，核苷功能菌生长适宜pH值范围为5～7，最适pH值为5，初始pH值低于5或高于7都不利于核苷功能菌的生长。

3　小结与展望

3.1对核苷功能菌菌株形态及生长特性分析，并结合代谢产物，初步认为核苷功能菌属于麦角菌科真菌，有很高的利用价值和开发前景。

3.2由核苷功能菌培养特性研究可知，核苷功能菌能利用多种碳源、氮源和无机盐。碳源中，二糖的利用效果较好，其中以蔗糖为最佳；氮源中，有机氮源的利用效果较好，如牛肉膏或酵母膏；无机盐中以Na2HPO4为最佳。

3.3核苷功能菌适宜的生长温度范围为18～25℃，最适温度为22℃；适宜的pH值范围为5～7，最适pH值为5。

3.4通过对核苷功能菌生物学特性的研究，明确了核苷功能菌的生长与代谢特性，下一步将针对代谢产物中的多糖和核苷类似物进行深度开发和应用。

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The Biological Properties of Nucleoside Functional Bacteria

ZHOU Xinhu,CHEN Xiang，YANG Yong，LI Zhe，YAN Qimei，GAN Guangdong，SONG Bao and TAN Hongdi
（Jiangsu Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

Abstract:In order to acquire a clear understanding of the formation mechanism of nucleoside analogs in liquor,the biological properties of nucleoside functional bacteria screened from the brewing environment in Yanghe Distillery were studied.Through the analysis of the morphology,metabolites and culture conditions of nucleoside functional bacteria,the results showed that,the nucleoside functional bacteria belong to Clavicipitaceae family,and it could produce polysaccharides,adenosine and D-mannitol etc.;its optimum growth temperature ranges from 18 to 25℃and the best is at 22℃;its optimum pH range is 5 to 7 and the best is 5;it could take advantage of varieties of carbon source,nitrogen source and inorganic salts,and sucrose is the best among all the carbon source,organic nitrogen source (yeast extract ) is the best among all the nitrogen source,and Na2HPO4is the best among all inorganic salts.

Key words:nucleoside;biological properties;metabolism;culture conditions

作者简介：周新虎（1962-），男，江苏宿迁人，硕士，高级工程师，江苏洋河酒厂股份有限公司副总裁、总工程师，白酒国家评委，中国首席品酒师、中国评酒大师，曾获全国五一劳动奖章，江苏省突出贡献专家等荣誉称号。

收稿日期：2015-11-13

中图分类号：TS262.3；Q93-3；TS261.1

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）02-0051-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015430

优先数字出版时间：2015-12-01；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151201.1301.001.html。