高通量测序中拼接问题的研究现状

徐鹏昊

（复旦大学生命科学学院，上海200433）

高通量测序中拼接问题的研究现状

徐鹏昊

（复旦大学生命科学学院，上海200433）

近年来，随着第二代测序技术的普及和第三代测序技术的逐步发展，高通量测序技术在实际研究中的应用越来越广泛。高速率、高性价比是其主要优点。相对于传统的桑格（Sanger）法测序来言，高通量测序得到的片段长度较为短小，故如何拼接得到完整的序列一直是炙手可热的研究方向。本文总结了现阶段高通量测序中拼接问题的研究结果，针对现在流行的各种算法进行了简单介绍。

高通量测序；reads拼接；contigs组装；OLC、De brujin图

一、测序技术的发展过程和现状［1］

（一）桑格法

桑格法又叫做双脱氧链终止法，由Sanger在1977年提出。通过加入带有放射标记的ddNTP（双脱氧核苷酸）使DNA合成终止。再通过电泳，并使用放射自显影技术读出碱基。此方法得到的片段较长，能达到1000bp左右。

（二）第二代测序技术

随着科学技术的发展，传统的桑格法已经不能满足研究的需要。科学家们需要更快的速度、更高的通量以及更低廉的价格，于是第二代测序技术应运而生。其核心思想是边合成边测序。现在主要有454 GS FLX、SOLiD和Illumina/Solexa Genome Analyzer三个平台。第二代测序是现阶段测序技术的主流，也是高通量测序的开始。

（三）第三代测序技术

第三代测序技术是指单分子测序技术。不需要经过PCR的过程即可测序，速度可以达到每秒十个碱基。通量更大，读长更短，是现阶段测序技术的发展方向。

二、高通量测序中的拼接工作

（一）高通量测序所得片段的特点

高通量测序之后所得到的序列片段称为reads（读取），其主要特点两点。一是长度短，一般在200bp以下，最长的454平台能达到的长度也不过1000bp，因此需要进行大量的拼接才能得到整条DNA序列。二是有部分重叠，由于测序位置具有随机性，故各reads总会有一定的重叠，这些重叠是拼接工作的关键。

（二）拼接过程

整个拼接过程分为两步。第一步，考察reads的重复序列，并拼接成更长的片段，称为contigs（重叠群），这一步称为reads的拼接；第二步，确定contigs之间的顺序关系，并按此排列，形成称为scaffolds的序列，这一步叫做contigs的组装。

三、Reads的拼接

（一）拼接过程的难点

reads拼接过程中要克服的难点主要有两点，一是高通量测序得到的reads长度较短，故内含信息较少，不易确认相对顺序。二是远程连接信息（Long-range linking information）的不可靠性。2这两点制约着reads拼接过程的准确率。

（二）方法［3］

reads拼接过程中算法的基本要求是de novo（从头测序），即不需要任何序列信息即可对原料进行测序。由此衍生出两种主流的算法：

1.OLC

OLC，即交叠-排列-共有序列算法 （Overlaplayout-consensus），是一个比较传统的算法，其基本思想为根据reads间的重复部分，确定可能性的reads连接顺序。

其步骤为：构建交叠图：对每两个reads进行比对，计算它们的重叠度——排列reads：将reads进行排列，确定它们之间的相对位置，建立overlap图——生成共有序列：通过多序列比对等方法，确立最后的contig。

OLC算法的计算量主要体现在交叠图的构建，而高通量测序得到的海量短序列有大量的交叠，往往需要大量的运算时间。故OLC算法并不适合现在高通量测序的发展趋势。现在某些拼接软件，如Shorty、CABOG等仍在使用基于此的算法。虽然这些软件针对OLC算法有一定的改进和优化，但其拼接速度和准确性仍受到限制。

2.De brujin图

基于De brujin图（DBG）的算法是现在最流行的算法，许多常用的拼接软件如Velvet、ABySS等都在使用这种算法。其特点为把基因序列的拼接问题转化为了数学上的图论问题，大大提高了拼接效率。

（1）基本思想

reads中连续的 k个碱基称为 k-mer，作为DBG的节点，两个k-mer如果在同一read中相邻，则形成一条边。故每个read都会对一些边加权，最后形成一个含有节点、有权值的边的DBG，由此生成最佳的contig。

（2）步骤

筛选reads：对reads进行检测，去除掉可能错误的reads——确定k值：k的值直接影响速度和精度。K值较大时，精度有所提高，但更容易受覆盖率的影响。故应该根据覆盖率、reads长度等确定合适的k值——处理DBG：根据确定的k值，做出DBG，同时完成化简和修正——根据DBG，拼接成contig。

（3）优缺点

DBG算法在处理海量短reads的时候效果优秀，与现在测序技术的发展趋势相匹配。然而，由于k-mer的长度较短，此方法受重复序列、测序错误的影响较大。

（三）不同拼接软件的效果差异

不同的拼接软件在reads拼接过程中表现为三点：一是比起软件来说，reads质量对拼接结果影响更大；二是与标准序列的接近度随reads和拼接软件的不同有很大改变；三是各软件拼接的正确率差别很大，但与接近度的结果不一致。

四、Contigs的组装

与reads的拼接相比，contigs的组装的难度相对较小。这是因为contigs的长度较reads长很多，所含信息较多。故可以较为准确的组装成scaffold

（一）组装过程的难点［4］

Contigs组装过程中的难点主要有二。一是contigs中含有大量的重复序列，不易确定contigs之间的相对顺序；二是由于contigs由reads拼接而成，其中不免会有一些错误，这些错误也会对contigs的组装产生干扰。

（二）方法

Contigs组装的方法较reads拼接而言较多，一般常用的有图论法和光学图谱法（Optical mapping）两种。

1.图论法［5］

图论法是比较传统的方法，与reads拼接有相似的地方。它以contigs作为节点，由相连的读取对（Linking reads pair）作为边，由此形成算图。

其一般步骤为：库的构建：构建出含有所有reads的库——计算相连读取对之间的距离，并由此计算gap的长度——把长度放在边上，作为算图的数据。

其理想的输出结果是一条scaffold序列，对应一条染色体，包含以正确顺序排列的contigs和contigs之间gap的长度。

2.光学图谱法［6］

光学图谱法是一种较为新颖的方法。通过内切酶将DNA切断，此时DNA片段的谱表现出一种特殊的指纹或是识别码的性质。利用光学方法追踪此信息得到相对位置，由此组装成正确的scaffold。

主要步骤为：将 contigs放置在光学图谱上——修正光学图谱——做出contigs的连接图，由此决定最佳的contigs连接顺序。

光学图谱法的组装结果有着很高的覆盖率，巧妙运用光学图谱法可以获得很高的成本效益。

有研究表明，当与454平台获得的实验结果相结合的时候，光学图谱法可以迅速、价廉的得到排列好的定向的contigs组，由此可以产生一个将近完整的基因组。

（三）发展方向

Contigs组装过程的关键点在于如何得到正确的连接顺序。现阶段此方面研究多集中在这一方向。

五、前景与展望

随着生物学研究向微观、向基因领域逐步延伸，高通量测序作为获得基因序列的主要方法，越来越受到重视，拼接技术也在不断发展。高通量测序的基因片段会变得海量且短小，应对此变化，拼接技术也会由确定“唯一的基因序列”向确定“最可能的基因序列”完成转变。因此，新一代的拼接技术会在准确率、覆盖率和速度上，作出超于现在拼接技术的改进。

［1］Anderson MW，Schrijver I.Next Generation DNA Sequencing and the Future of Genomic Medicine.？Genes. 2010；1（1）：38-69.doi：10.3390/genes1010038.

［2］Salzberg SL，Phillippy AM，Zimin A，et al.GAGE：A critical evaluation of genome assemblies and assembly algorithms.Genome Research.2012；22（3）：557-567.doi：10.1101/gr.131383.111.

［3］Deng X，Naccache SN，Ng T，et al.An ensemble strategy that significantly improves de novo assembly of microbial genomes from metagenomic next-generation sequencing data.Nucleic Acids Research.2015；43（7）：e46.doi：10.1093/ nar/gkv002.

［4］Latreille P，Norton S，Goldman BS，et al.Optical mapping as a routine tool for bacterial genome sequence finishing.BMC Genomics.2007；8：321.doi：10.1186/1471-2164-8-321.

［5］HuntM，NewboldC，BerrimanM，OttoTD.A comprehensive evaluation of assembly scaffolding tools. Genome Biology.2014；15（3）：R42.doi：10.1186/gb-2014-15-3-r42.

［6］NagarajanN，ReadTD，PopM.Scaffoldingand validation of bacterial genome assemblies using optical restriction maps.Bioinformatics.2008；24（10）：1229-1235. doi：10.1093/bioinformatics/btn102.

编辑：冯惟榘

The Recent Research Progress Af High-throughput Sequencing's ASsembling

XU Penghao
（School of Life Sciences Fudan University，Shanghai 200433）

In recent years，with the popularization and gradual development of the second-genaration sequencing technique，High-throughput Sequencing has been widely applied in the practical studies.Its main advantages are the high speed and cost-effectiveness.Relative to the traditional Sanger method，the High-throughput Sequencing's fragment length is fairly shorter.Therefore，how to assemble the fragments into a complete sequence has always been an attracting study field.This paper summarized the research findings of High-throughput Sequencing's assembling part at this stage，and briefly introduced the various popular algorithms.

High-throughput Sequencing；Reads Assembling；Contigs Assembling；OLC，De Brujin Graph

F326

A

2095-7327（2016）-01-0042-03

徐鹏昊，男，山东济南人，复旦大学生命科学学院，主要研究方向为生物技术、生物信息。