顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响*

张立伟　刘芳芳　于利　王爱梅



·实验研究·

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响*

张立伟1刘芳芳1于利1王爱梅1

【摘要】目的观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶(calpain)表达的影响，探讨顺铂致耳蜗毛细胞凋亡的机制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只(600耳)，分离出耳蜗基底膜600条，体外培养24 h后，随机分为对照组和4、8、16 μg/ml顺铂组，每组150条；对照组加入2ml新鲜培养基，顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂(4、8、16 μg/ml)的新鲜培养基，再继续培养24 h后，应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况，并应用免疫荧光染色和免疫印迹(Western blot)技术检测calpain 1(μ-calpain)和calpain 2(m-calpain)在耳蜗毛细胞的表达。结果4、8、16 μg/ml顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为15.63%±0.20%、38.40%±2.64%和64.24%±0.05%，均高于对照组(5.55%±0.12%)，呈现明显的量效关系；不同浓度顺铂组μ-calpain和m-calpain的表达均较对照组明显增强(P<0.01)，且m-calpain的表达随顺铂浓度的增高而明显增强(P<0.01)。结论顺铂可通过calpain通路诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡，从而发挥毒性效应。

【关键词】顺铂；耳蜗；毛细胞；钙蛋白酶；小鼠

钙蛋白酶(calpain)为一种钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶，可参与细胞骨架重构、信号传导、细胞凋亡与坏死等多种生理病理过程[1]。生理状态下，细胞内的calpain主要以无活性的酶原形式存在，仅少部分被激活，以维持机体的正常活动；在病理状态下，钙离子浓度的异常增高可持续激活calpain，进而降解细胞骨架、膜蛋白以及各种激酶和转录因子，最终诱导细胞凋亡和坏死。文献报道，在体情况下，顺铂导致成年BALB/c小鼠听功能下降的同时伴耳蜗calpain的高表达，提示calpain介导了顺铂对成年BALB/c小鼠的耳毒性损伤[2]。在离体情况下，顺铂是否也能诱导耳蜗calpain的高表达目前为止尚不明确。因此，本研究拟通过观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞calpain表达的影响，为进一步探讨顺铂的耳毒性机制及其防护提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料实验动物为生后3 d的健康昆明小鼠300只(600耳)，雌雄不限，由辽宁医学院实验动物中心提供；顺铂和牛血清白蛋白购自美国Sigma公司，DMEM/F12培养基购自美国Invitrogen公司，Hoechst 33258购自上海碧云天生物技术研究所，兔抗calpain 1(μ-calpain)和抗calpain 2 (m-calpain)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；Mini-PROTEAN电泳仪由美国Bio-Rad公司生产，MCO-15A型CO2培养箱由日本SANYO公司生产，Zeiss-A1显微镜由德国Zeiss公司生产EDAS290凝胶成像分析系统由日本Kodak公司生产。

1.2实验方法

1.2.1分离小鼠耳蜗基底膜将全身消毒后的小鼠断头，用剪刀沿矢状缝剪开颅骨，去除脑组织以充分暴露颅底。体视显微镜下分离出整个耳蜗，移入预冷的Hanks液中。打开耳蜗壳，依次剥离螺旋韧带、血管纹及前庭膜，将基底膜沿蜗轴完整分离，共分离出600条耳蜗基底膜。

1.2.2小鼠耳蜗基底膜离体培养将10 μl胶原凝胶液滴在培养皿中，室温下放置15～20 min使其凝固。然后加入1 ml无血清培养基。将分离后的基底膜移入培养皿中，再逐渐沿胶滴边缘将基底膜正面朝上平铺到胶滴表面。37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后，再加入1 ml培养基，使培养基完全覆盖胶滴，然后放回CO2培养箱中继续培养24 h。

1.2.3实验分组及离体顺铂耳毒性模型制备24 h后，弃去原培养基，将基底膜随机分为对照组和4、8、16 μg/ml顺铂组，每组150条。对照组加入2 ml新鲜培养基，其余3组分别加入2 ml含有不同浓度顺铂(4 μg/ml、8 μg/ml和16 μg/ml)的新鲜培养基，继续培养24 h后，每组随机取10条基底膜用于进行Hoechst 33258荧光染色以观察毛细胞凋亡，10条基底膜用于进行μ-calpain的免疫荧光染色，10条基底膜用于进行m-calpain的免疫荧光染色，其余的120条基底膜每20条基底膜合为一份标本，每组共6份标本，于-80 ℃冰箱中保存，分别用于进行μ-calpain和m-calpain的Western blot检测。

1.2.4Hoechst 33258荧光染色和耳蜗凋亡毛细胞计数终止实验时吸出培养基，PBS漂洗后加入4 %多聚甲醛，4 ℃下固定过夜。次日PBS 漂洗，然后向培养皿中加入0.3 % TritonX-100溶液室温下作用30 min。倾去Triton X-100溶液后，PBS 漂洗，然后加入Hoechst 33258(2.5 μg/ml)室温下避光染色10 min。PBS 漂洗后，将带有基底膜的胶粒移至滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，盖上盖玻片。荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞形态变化并拍照。

各组在荧光显微镜下，从耳蜗基底膜底端向顶端(不考虑基底膜长度)选取200个毛细胞，计数其中凋亡的毛细胞个数(细胞核呈高亮状态、出现核固缩、核碎裂的毛细胞判定为凋亡毛细胞)，并计算毛细胞凋亡百分率(毛细胞凋亡率=凋亡毛细胞数/200×100%)。

1.2.5calpain免疫荧光染色终止实验时吸出培养基，PBS 漂洗后加入4 %多聚甲醛，4 ℃下固定过夜。次日PBS 漂洗，然后向培养皿中加入0.3 % TritonX-100溶液室温下作用30 min。倾去Triton X-100溶液后，PBS 漂洗，然后加入10 %山羊血清，37 ℃下孵育30 min。滴加抗μ-calpain或抗m-calpain抗体(均1:100稀释)，4 ℃下过夜。次日，PBS漂洗后，滴加TRITC标记的羊抗兔二抗，37 ℃下避光孵育30 min。PBS漂洗后，将带有基底膜的胶粒移至滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，盖上盖玻片。荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞calpain的表达情况并拍照。

1.2.6calpain免疫印迹(Westen blot)检测于离心管中加入RIPA裂解液，0 ℃下超声粉碎，4 ℃下离心25 min(12000转/min)。取上清并测定蛋白含量。灌胶后每条泳道加入80 μg蛋白样品，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，再加入5 %脱脂奶粉溶液中，4 ℃下摇床孵育1 h后，加入抗μ-calpain或抗m-calpain抗体(均1:1000稀释)，4 ℃下过夜。TBST缓冲液冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1: 1000稀释)，4 ℃下摇床孵育1 h。TBST缓冲液冲洗后滴加ECL化学发光剂，曝光、显影后得到电泳条带。应用凝胶成像分析系统测定各电泳条带的灰度值。β-actin作为内参照物，以calpain/β-actin比值代表calpain的蛋白表达水平。

1.3统计学方法应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，各组间数据比较采用单因素方差分析及SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1各组离体小鼠耳蜗毛细胞的凋亡比较经Hoechst 33258染色后，对照组小鼠耳蜗毛细胞核多呈淡蓝色，核内染色质分布比较均匀(图1a)；而不同浓度顺铂组小鼠耳蜗毛细胞核则出现固缩，呈亮蓝色，核内染色质边集；并且随着顺铂浓度的增高，致密浓染的细胞核亦显著增多(图1b～1d)。耳蜗凋亡毛细胞计数结果显示，对照组小鼠耳蜗毛细胞凋亡率为5.55%±0.12%，而不同浓度顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率呈剂量依赖性增大，与对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)(表1)。

2.2各组离体小鼠耳蜗毛细胞calpain表达比较

2.2.1calpain免疫荧光染色结果荧光显微镜下观察，可见μ-calpain和m-calpain在对照组小鼠耳蜗毛细胞均呈微弱红色荧光(图2a、3a)；不同浓度顺铂组小鼠耳蜗毛细胞μ-calpain和m-calpain红色荧光均较对照组有所增强，但不同浓度顺铂组间μ-calpain荧光强度基本相同(图2b～2d)，而m-calpain荧光则随顺铂浓度的增高而明显增强(图3b～3d)。

2.2.2calpain免疫印迹(Westen blot)检测结果对照组出现较弱的μ-calpain和m-calpain电泳条带；不同浓度顺铂组μ-calpain和m-calpain电泳条带均明显加深(图4)。电泳条带密度分析结果显示，不同浓度顺铂组μ-calpain/β-actin比值和m-calpain/β-actin比值均较对照组明显增大(P<0.01)，即μ-calpain和m-calpain表达显著增强，但顺铂组间μ-calpain表达无显著性差异(P>0.05)，而m-calpain的表达则随顺铂浓度的增高而明显增强(P<0.01)(表2)。

图1　各组离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡的Hoechst 33258检测(×400)

图2　各组离体小鼠耳蜗毛细胞μ-calpain的表达(免疫荧光染色×400)

a.对照组；b.4 μg/ml顺铂组；c.8 μg/ml顺铂组；d.16 μg/ml顺铂组。对照组荧光较弱，而不同浓度顺铂组荧光较对照组明显增强，但顺铂组间荧光强度无明显差异

图3　各组离体小鼠耳蜗毛细胞m-calpain的表达(免疫荧光染色×400)

a.对照组；b.4 μg/ml顺铂组；c.8 μg/ml顺铂组；d.16 μg/ml顺铂组。对照组荧光较弱，而不同浓度顺铂组荧光明显强于对照组，并且随着顺铂浓度的增高而显著增强

图4　各组离体小鼠耳蜗毛细胞μ-calpain和m-calpain的电泳条带

组别毛细胞凋亡率对照组5.55±0.124μg/ml顺铂组15.63±0.20*8μg/ml顺铂组38.40±2.64*#16μg/ml顺铂组64.24±0.05*#▲

注：*与对照组比较，P<0.01；#与4 μg/ml顺铂组比较，P<0.01；▲与8 μg/ml顺铂组比较，P<0.01

表2　各组离体小鼠耳蜗毛细胞μ-calpain/β-actin和

注：*与对照组比较，P<0.01；#与4 μg/ml顺铂组比较，P<0.01；▲与8 μg/ml顺铂组比较，P<0.01

3讨论

calpain是一种依赖钙离子激活的中性半胱氨酸蛋白酶，该酶主要包括两种同分异构体，即calpain 1和calpain 2。calpain 1只需微摩尔浓度的钙离子就可被激活，故又称μ-calpain；而calpain 2则需毫摩尔浓度的钙离子才能被激活，故又称m-calpain。正常时细胞内calpain主要以无活性的酶原形式存在，当细胞内钙离子浓度异常升高后，酶原N末端肽键发生自溶性断裂而被活化。活化的calpain可对多种细胞骨架蛋白、离子通道和与信号转导有关的G蛋白及酶等产生降解作用，从而改变蛋白质结构和酶的功能，最终诱导细胞凋亡和坏死[3]。

近年来的研究表明，多种耳毒性药物所致的内耳细胞凋亡都与calpain有关[4～8]。Yu等[4]研究发现，经卡那霉素处理后，小鼠耳蜗细胞发生了凋亡，同时伴有calpain的高表达，提示calpain参与了卡那霉素所致小鼠耳蜗细胞凋亡。Chang等[2]观察到成年小鼠腹腔注射不同剂量顺铂5 d后，小鼠ABR阈移明显增大，与此同时耳蜗毛细胞中μ-calpain和m-calpain的表达较正常对照组明显增强，并且随着顺铂给药剂量的增大，m-calpain的表达亦逐渐增强，表明calpain也介导了顺铂对小鼠耳蜗毛细胞的损伤，该结果与本研究结果基本一致。本研究将不同浓度顺铂作用于离体培养的小鼠耳蜗基底膜24 h后，观察到凋亡毛细胞数较对照组明显增多，并且随着顺铂浓度的逐渐增高，毛细胞凋亡率显著增大；同时顺铂组μ-calpain和m-calpain的表达亦较对照组明显增强，由此提示在离体情况下，顺铂也能诱导小鼠耳蜗calpain的高表达，使毛细胞凋亡增多。此外，本研究还观察到μ-calpain的表达并不随顺铂浓度的增高而增强，提示μ-calpain可能在顺铂诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡的过程中不起主要作用。

目前，关于活化的calpain进一步引起细胞凋亡的机制尚未完全清楚，一般认为通过以下两条途径：① 线粒体途径：细胞内钙离子浓度增高时可使calpain被激活，活化的calpain能切割细胞浆中的凋亡蛋白Bid，使其活化；Bid通过与位于线粒体的跨膜蛋白Bak结合，使Bak构象发生变化，形成孔隙，从而使线粒体外膜的渗透性增加，线粒体内的细胞色素C释放出来，最终导致细胞凋亡；② 蛋白水解途径：calpain过度活动可降解细胞骨架蛋白、血影蛋白、钙调蛋白激酶和ADP核糖转移酶等，最终导致细胞凋亡[9]。至于在本研究中，calpain 是否通过上述机制导致耳蜗毛细胞凋亡，有待进一步研究。

4参考文献

1Neuhof C, Neuhof H. Calpain system and its involvement in myocardial ischemia and reperfusion injury [J]. World J Cardiol, 2014, 6: 638.

2Chang L, Wang AM. Calpain mediated cisplatin-induced ototoxicity in mice [J]. Neural Regen Res, 2013, 8: 1995.

3Branquinha MH, Marinho FA, Sangenito LS, et al. Calpains: potential targets for alternative chemotherapeutic intervention against human pathogenic trypanosomatids [J]. Curr Med Chem, 2013, 20: 3174.

4Yu L, Tang H, Jiang XH, et al. Involvement of calpain-I and microRNA34 in kanamycin-induced apoptosis of inner ear cells [J]. Cell Biol Int, 2010, 34: 1219.

5Momiyama J, Hashimoto T, Matsubara A, et al. Leupeptin, a calpain inhibitor, protects inner hair cells from aminoglycoside ototoxicity [J]. Tohoku Journal of Experimental Medicine, 2006, 209: 89.

6Coffin AB, Williamson KL, Mamiya A, et al. Profiling drug-induced cell death pathways in the zebrafish lateral line [J]. Apoptosis, 2013, 18:393.

7Ladrech S, Guition M, Saido T, et al. Calpain activity in the amikacin-damaged rat cochlea[J]. J Comp Neurol,2004,477:149.

8Jiang H, Sha SH, Forge A, et al. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo[J]. Cell Death and Differention, 2006, 13: 20.

9王苹, 杜波, 杜宝东. 钙蛋白酶活性及其诱导内耳细胞死亡[J]. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2006, 30: 354.

(2015-05-04收稿)

(本文编辑雷培香)

The Effects of Cisplatin on the Expression of Calpain in Mouse Cochlear Hair Cell in Vitro

Zhang Liwei, Liu Fangfang, Yu Li, Wang Aimei

(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou, 121001, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of cisplatin on the expression of calpain in mouse cochlear hair cells in vitro, and to explore the mechanism of cisplatin-induced apoptosis in mouse cochlear hair cells. MethodsA total of 600 cochlear basilar membranes isolated from Kunming mice at postnatal day 3 were cultured for 24 hours, then randomly divided into control group and 3 cisplatin groups (4 μg/ml, 8 μg/ml and 16 μg/ml). Each group contained 150 basilar membranes. Four groups were continually cultured for another 24 hours. Hoechst 33258 staining was used to detect the apoptosis of cochlear hair cell. Immunofluorescent staining and Western blot were carried out for detecting the expressions of calpain 1 (μ-calpain) and calpain 2 (m-calpain) in mouse cochlear hair cells. ResultsThe percent of apoptotic hair cells in the three cisplatin groups (15.63%±0.20%, 38.40%±2.64% and 64.24%±0.05%, respectively) was greater than that of in the control group (5.55%±0.12%), showing a clear dose-response relationship (P<0.01). Furthermore, the expressions of μ-calpain and m-calpain in different cisplatin groups were increased, and m-calpain expression was great remarkably with increased concentration of cisplatin (P<0.01).ConclusionOur results suggest that cisplatin can induce the apoptosis in mouse cochlear hair cells by regulating calpain pathway. This may play a role in the cisplatin-induced ototoxicity.

【Key words】Cisplatin；Cochlea；Hair cell；Calpain；Mouse

【中图分类号】R764.43

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2016)02-0167-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.014

作者简介：张立伟，男，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为听觉生理与病理。通讯作者：王爱梅(Email: aimeiwang88@163.com)

网络出版时间：2015-12-2815：12

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1512.012.html

*辽宁省自然科学基金(2014022029)资助

1辽宁医学院生理学教研室(锦州121001)