甘油检测技术研究进展

冯东，李秋顺，王丙莲，史建国

(山东省生物传感器重点实验室，山东省科学院生物研究所，山东 济南 250014)



【生物传感器】

甘油检测技术研究进展

冯东，李秋顺*，王丙莲，史建国

(山东省生物传感器重点实验室，山东省科学院生物研究所，山东 济南 250014)

摘要：甘油是重要的工业原料，在国防、化工、油漆、食品、日化、医药、农药及生物制品等领域有着广泛的应用，对发酵产品产量的控制、柴油的质量控制、化妆品的保鲜性及冷冻血液处理后的可用性等具有重要的作用。本文综述了高碘酸氧化法、Cu2+比色法和酶催化反应-分光光度法等近年来测定甘油含量方法的应用进展，认为甘油测定方法的未来发展趋势是传统检测技术与新纳米材料、新检测技术的融合，应进一步提高对甘油检测的专一性、灵敏性，实现甘油含量检测的仪器化、自动化、微型化以及快速化，并借助互联网和云技术，实现对甘油含量的连续、遥控、实时与在线监测。

关键词：甘油；检测方法；进展

甘油，学名1，2，3-丙三醇，简称丙三醇，是一种无毒、无臭、无腐蚀性、无色或微黄色、味甜并具有较强吸湿性的透明粘稠液体[1]。

甘油是重要的工业原料，在国防、化工、油漆、食品、日化、医药、农药及生物制品等领域有着广泛的应用[1-3]。在食品领域，甘油是食品加工业中通常使用的甜味剂和保湿剂，能分解果汁、果醋和果酒等饮料中的苦涩异味，增进其香味，提升其品质和口感，甘油的含量是判断其品质的重要指标之一[2]。在医学上，甘油是重要的药用辅料，被用作制剂中的润滑剂、湿润剂、注射剂或胃肠道用药的溶剂[4]。在生活中，甘油被用于化妆品等产品的锁水、保湿和矫味[5]。在工业上，甘油被用作化学原料或中间产物，制造合成树脂、塑料、油漆、硝酸甘油、油脂和蜂蜡等[6-8]。在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程菌的发酵密度，提高产品生产率的关键[9]。在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一[10]。此外，甘油能与水结合以防止红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等[11]。由于甘油用途很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。本文综述了目前国内外常用的甘油分析方法及最新应用进展情况，以期为优化甘油检测的工艺条件和探索检测甘油的新方法和新技术提供借鉴。

1甘油的检测方法

目前国内外甘油含量的测定方法较多，主要有高碘酸氧化法、Cu2+络合比色法、甘油激酶法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法以及原子吸收法等。

1.1高碘酸氧化法

高碘酸氧化法具体可以分为三种方法：高碘酸氧化-酸碱中和法、高碘酸氧化-滴定碘法和高碘酸氧化-分光光度法。

1.1.1高碘酸氧化-酸碱中和法

高碘酸氧化-酸碱中和法的测定原理是首先用过量的高碘酸钠或高碘酸钾在酸性溶液中将甘油氧化成甲酸和甲醛； 接着用乙二醇溶液还原之前氧化反应后过量的高碘酸根，而乙二醇被氧化成甲醛；然后采用中和滴定法，以酚酞作为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定氧化过程产生的甲酸，依据消耗氢氧化钠的量，计算出氧化产物甲酸的量，进而求出样品中甘油的含量。

康辉等[12]利用此法测定棒酸发酵液中甘油的含量，该方法的回收率为98.5%，相对标准偏差为1.69%。蒋小良等[13]在康辉研究的基础上，建立了高碘酸氧化法快速测定进口粗甘油中甘油含量的分析方法，重点考察了高碘酸钠加入量、溶液pH值和放置时间等主要因素对粗甘油中甘油含量准确测定的影响。经实验确定了最佳实验条件: 35 mL质量浓度为60 g/L的高碘酸钠溶液，pH在0.4～1.6之间，放置时间40 min。在选定实验条件下，该方法测定结果的相对标准偏差为1.26%(n=7)，加标回收率为97.2%～104.1%。

作为细胞内冷冻保护剂的甘油，在使用前，必须经过洗涤去除，使红细胞中甘油残留量小于或等于10 g/L，否则会导致不良反应，甚至生命危险，因此甘油含量测定是非常重要的。杨夏等[14]用高碘酸钠法检测冰冻解冻去甘油红细胞中的甘油残留量，对检测方法和监测流程进行了探讨、评价。结果显示，此法能准确监控冰冻解冻去甘油红细胞中甘油的残留量，检测甘油含量的相关度较高(R=0.999 9)，检测回收率平均为98.7%，检测CV≤3.2%。

1.1.2高碘酸氧化-滴定碘法

高碘酸氧化-滴定碘法的原理是高碘酸将甘油氧化生成甲醛与甲酸，自身被还原为碘酸，然后，在酸性介质中高碘酸和碘酸氧化碘化钾析出碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，利用这一特点，可达到测定甘油含量的目的。

彭晋平等[15]用此法对8个甘油试样进行测定，结果显示，该法操作简便，结果误差较小，测定的甘油含量准确性较好。

1.1.3高碘酸氧化-分光光度法

在高碘酸氧化后的产物中，可以进一步将产物与某种特定试剂进行反应，利用分光光度计找出吸光度的变化，进而判断出样品中甘油的含量。

吕扬效等[16]基于游离的甘油可被高碘酸氧化生成甲醛,甲醛与乙酰丙酮反应生成的衍生物在410 nm的波长下具有最大吸光度的现象,提出了一种用分光光度计准确测定油脂中微量甘油的方法。在测定的含量线性范围内,回收率为96.70%～99.43%,变异系数为0.73%～2.06%。此种方法定量准确,简便快捷,是一种理想的测定油脂中微量游离甘油的方法。

杨梅桂等[17]建立了利用乙酰丙酮分光光度法测定水中微量甘油含量的方法。他们通过对水中微量的甘油进行过氧化，生成乙醛，再加入乙酰丙酮与生成的乙醛反应，通过紫外分光光度计在414 nm波长处测定生成的黄色化合物的量计算样品中甘油含量。结果显示，该方法的相对标准偏差为1.0%～1.4%，加标回收率为99.6%～100.8%。实验表明，该方法精密度高、准确度好，是一种有效可行的方法。

王剑锋等[18]用高碘酸将甘油定量地氧化成甲醛(控制反应5 min)，然后将甲醛与变色酸发生特征性反应，在避光煮沸情况下，生成紫红色化合物，在670 nm下比色，用于发酵液中甘油的检测，取得了较好的效果。

Kuhn等[19]首先利用高碘酸反应将甘油定量地氧化成甲醛，然后用汉栖反应使乙酰丙酮、氨与甲醛结合生成在410 nm波长有较好吸收的3，5-二乙酰基-1，4-二氢二甲基吡啶染料，最后通过分光光度计检测毕赤酵母发酵液中的甘油。结果显示，这种方法无需对样本预处理，简便快捷且专一性较好。

1.2Cu2+比色法

Cu2+比色法的测定原理是在碱性条件下(pH=11～12)，甘油与Cu2+生成深蓝色络合物(甘油铜)，该络合物在630 nm波长下有最大吸收，用比色法即可对甘油进行测定。根据朗伯-比尔定律，配制一系列不同甘油含量的甘油铜溶液，在630 nm 波长处分别测定这些不同甘油含量溶液的吸光度，制作标准曲线，并得到回归方程。再用供试样品与Cu2+作用，测定吸光度，代入回归方程，得出甘油含量。

李盛林等[20]通过此法测定生物柴油制备过程中产生的甘油，计算生物柴油的转化率。结果表明，当甘油的质量分数在3%～9%时，其与吸光度的线性关系良好(R=0.998 4)，平均回收率在101.1%；与气质联谱比较，相同生物柴油样品转化率的测定值差值小于0.1%。

阎杰等[21]探讨了Cu2+比色法测定甘油含量的优化条件。结果表明，最佳测定条件为：取CuSO4溶液(0.05 g/mL)1 mL与碱液(0.05 g/mL)3.5 mL，摇匀，加入处理后的样品，振荡12 min，过滤，然后在波长630 nm处测定吸光度。实测显示，所建立的测定方法操作简单、速度快，相对误差为-1.33%～4.33%，变异系数为0.546%。

李玲艳等[22]在阎杰研究的基础上，改进了Cu2+比色法，用于碱催化酯交换法制备生物柴油过程中甘油含量的测定，确立了最佳测定条件：取3.5 mL 0.05 g/mL NaOH 与1 mL 0.05 g/mL CuSO4摇匀，加入3 min离心处理后的样品，超声5 min，离心3 min，然后在波长630 nm处测定吸光度。结果表明，改进后的方法操作简单，相对误差为-0.490%。

1.3酶催化反应-分光光度法

酶催化反应-分光光度法，又称甘油激酶法，也称为磷酸甘油氧化酶-过氧物酶法( GPO-POD)，它是利用酶的特异性催化反应建立的测定甘油的一种酶学方法，是指甘油在甘油激酶作用下转化为3-磷酸甘油，后者由磷酸甘油氧化酶催化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，然后过氧化氢和4-氨基安普比林、4-氯酚在过氧化物酶催化下反应生成紫兰色、能在500 nm左右有特征吸收峰的醌亚胺，通过颜色深浅即吸光度的变化测定所生成的H2O2，甘油的含量与生成的H2O2成正比，这样用比色法就可以测定甘油的含量。

周泽林等[23]利用此法检测发酵液中甘油含量，结果显示，甘油含量的显色线性范围0.1～0.9 g/L，甘油含量检测平均相对偏差2.02%，相对标准偏差为3.11%，由于酶的专一性强，只与溶液中的甘油特异性地反应，甘油含量检测结果几乎不受发酵液中其他物质的干扰。

王玉等[24]采用此法测定制剂中的微量甘油，结果显示，此法选择性强，不受其他共存组分的干扰，线性范围为 10 μg /mL～60 μg /mL(R=0.997 6)，方法回收率和测定结果满意，适合于微量或半微量甘油的测定。

刘青等[25]应用该法对部分进口和国产葡萄酒(包括采样的国产劣质葡萄酒)中的甘油含量进行了测定，实验表明，甘油含量在2.0～16.7 g/L浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.998 9；对不同的干红和干白葡萄酒，加标回收率为94.2%～118%；精密度和重复性(n=10)相对标准偏差均小于5%。因此，该方法能够用于对苹果酸-乳酸发酵过程控制和葡萄酒产品的质量检测。

1.4红外光谱法

在有机物分子中，组成化学键或官能团的原子处于不断振动的状态，其振动频率与红外光的振动频率相当。当用红外光照射时，分子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于不同位置，从而可获得分子中含有何种化学键或官能团的信息。由于每种分子都有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱，因此，红外光谱(4 000～400 cm-1)能够提供几乎所有物质的结构信息。

红外光谱法就是根据被测样品的红外光谱特征得到其成分及含量的一种方法。在测试过程中，样品无需预处理和消耗化学试剂，安全环保，能够用于固态、液态以及胶状态等各种样品的测试，具有分析高效、快速、可实现现场遥控检测而不破坏和干扰生产过程等优点，在很多领域中被广泛应用。

吴胜等[26]采用无机盐培养基毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶，以人工配置的甘油标准溶液作为建模集，利用红外光谱结合偏最小二乘法建立甘油的预测模型，模型的校正标准差和验证标准差分别为0.171和0.532 g/L。在5 L发酵罐中运用建立的模型预测发酵液中甘油的含量，预测标准误差为1.09 g/L，表明模型稳定，能有效指导实际生产。

李燕萍等[27]采用近红外光谱分析技术和偏最小二乘法，对原始光谱进行散射处理并结合最佳的数学处理组合建立了最佳的定量测定木薯乙醇发酵液中甘油含量的数学模型 “SNV+Detrend”+“1，4，4，1”模型。该甘油模型的内部交叉验证预测值和实测值的定标相关系数为0.896，相应的标准误差为0.053；外部验证预测值和真值之间的定标相关分数为0.934 2，标准误差值为0.040 0。通过与高效液相色谱法对照，数据接近且无显著性差异， 取得了较好的分析效果，说明该法对整个生产有着重大的指导意义。

李治华等[28]采用偏最小二乘法建立了快速测定高含量精制甘油中甘油含量的近红外光谱校正模型，该模型主因子数为4，相关系数(R2)为99.12%，校正标准偏差为0.027；以预测集对模型进行验证，结果表明，R2为99.17%，预测标准偏差为0.023，对同一样品预测值的相对标准偏差为0.04%。

1.5高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)的原理是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，利用色谱柱对待测混合物先进行分离，然后再进行检测，从而实现对试样的分析，因而其测量的准确性和精确度较高，目前已成为检测生化分子较常用的一种方法。

黄滔敏等[29]利用此法测定复方甘油注射液中的甘油含量。他们采用Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，缓冲液(0.01 mol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH值至2.5)-乙腈(65∶35，V/V)的流动相，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长227 nm，以对甲苯磺酰异氰酸酯(TSIC)为衍生化试剂，将甘油衍生化后进行含量测定。结果在该色谱条件下，甘油线性方程为y=327.74x+18.64(R=0.999 7，n=7)。加样回收率为97%～103%(n=3)，相对标准偏差小于3%(n=3)。衍生化样品在12 h内稳定,测得样品中甘油为97%～103%。

李忠等[30]用此法测定烟草料液样品中的甘油含量。烟草料液用Sep-Park-C18固相萃取小柱预分离，以Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换柱为固定相，0.05 g/L EDTA钙钠水溶液为流动相，示差折光仪为检测器。线性范围为0.005～5 g/L，检测限在1.5～2.5 mg/L之间，相对标准偏差为0 .89%～1.3%，标准回收率在96 .0%～103%之间。

杨军等[31]用此法检测基因工程菌发酵液中的甘油含量。他们使用Aminex HPX-87H column(300 mm×7.8 mm，9 μm)，以5 mmol/L H2SO4溶液作为流动相，在柱温35 ℃、流速0.60 mL/min的条件下，用示差折光检测器进行检测，采用外标法定量。结果色谱峰理论塔板数均大于8 500，各峰之间的分离度均大于4.5，阴性对照在相应位置处未见色谱峰；在标准曲线线性范围内，甘油含量与峰面积均呈良好的线性关系，相关系数在0.999 97～0.999 98之间；甘油的平均加样回收率为103.84%；该方法重复6次检测发酵液，甘油峰面积的相对标准偏差为0.21%。

1.6气相色谱法

气相色谱分析法是用于分离分析复杂样品中的化合物的一种方法，其原理是一定量的气体或液体分析物被注入到柱一端的进样口中，在载气带动下通过色谱柱，分析物的分子会受到柱壁或柱中填料的吸附。由于不同的样品具有不同的物理和化学性质，与特定的固定相有着不同的相互作用，使得每一种类型的分子都有自己的通过速率，因此，分析物中的各种不同组分就会在不同的时间到达柱的末端，从而得到分离。当化合物从柱的末端流出时，它们被检测器检测到，产生相应的信号，并被转化为电信号输出，从而确定每一个组分到达色谱柱末端的时间顺序以及每一个组分的含量。

马丽敏等[32]利用此法分析牙膏中的甘油含量。他们以正十四烷作为内标，采用DB-FFAP毛细管柱分离样品，氢火焰离子化检测器测定牙膏中甘油的含量。结果表明，该方法分离完全、峰形对称、出峰快、精密度和准确度高、回收率好且灵敏度高，线性方程为Y=0.384 7C-0.009 5，相关系数R=0.999 6，线性范围为0.01～3.0 mg/mL，最低检测浓度为2.58 μg/mL，平均回收率为96.2%，相对标准偏差为1.29%。

李丹等[33]利用气相色谱法直接测定生物柴油副产物粗甘油中的甘油含量。他们采用四氢呋喃-水(3∶1，V/V)混合溶剂溶解粗甘油样品，以二乙二醇二乙醚作内标，直接在HP-5柱上进行GC法分离，并采用内标法定量，对溶剂、内标物、色谱柱和进样量等参数进行了优化，在最佳实验条件下，甘油含量在0～20 g/L范围内线性良好，相关系数为0.999 94。对实际样品进行8次平行测定，相对标准偏差为0.68%～0.91%。对样品进行高、中、低3个水平的加标回收实验，回收率在95%～105%之间。该方法中所选用的溶剂和内标物均不会和体系中的物质发生化学反应，操作简便、分析快速且结果准确，适用于粗甘油中游离甘油的测定，能够满足生产企业和相关检测机构的实际工作需要。

范硕等[34]采用此法测定清开灵注射液中的甘油含量，采用气相色谱(GC)法，检测器为FID，检测器温度为250 ℃；色谱柱为石英毛细管柱(0.32 mm×30 m，1.8 μm，Agilent DB-624)；进样口温度为200 ℃；柱温：起始温度140 ℃，保持10 min；以50 ℃/min速率升温到220 ℃后，维持5 min，再以50 ℃/min速率升温到240 ℃后，维持8 min，载气为N2。结果显示，在0.248 6 mg/mL～2.485 5 mg/mL的含量范围内，甘油含量与峰面积的线性关系良好；平均加样回收结果为99.8%，相对标准偏差为0.4%。

Somboon等[35]采用气相色谱质谱联用技术测定尿液中的甘油含量，检出限0.2 μg/mL，线性范围为0.2 μg/mL～117.0 μg/mL，线性相关系数为0.990，精度为78%～115%，3.66、14.83、 58.5 μg/mL尿样中甘油的回收率分别为 78.60%、103.69%、115.97%，并且有较好的重复性和稳定性，能够满足医学临床中的需要。

2存在问题

虽然甘油的测定方法很多，但这些方法在各自具有一些优点的同时，都存在不足之处。

(1)高碘酸氧化法不需任何特殊设备和昂贵的试剂，所用试剂便宜、费用较低，是最常用的甘油定量方法，目前国内血站普遍采用此法检测甘油残余量，但该方法耗时长、试剂用量大且试剂不易保存，结果靠肉眼判读人为误差大。同时，其操作步骤繁琐,多羟基或邻羟酮基类化合物对检测结果产生干扰，结果的重复性及稳定性较差。

(2)高效液相色谱法精密度高、灵敏度好且不易受其他物质的干扰，在生物柴油体系中的应用比较广泛，但需使用折光示差检测器，对环境要求相当严格，重复性不佳。而且存在仪器设备昂贵、系统平衡时间长、所需标准品量大以及受外界条件影响较大等缺点。

(3)气相色谱法比较灵敏且精确度较高，但需对甘油进行硅烷化衍生反应处理，操作繁琐，需要配备昂贵的设备，检测成本较高。

(4)Cu2+比色法操作步骤简单，但准确度不高、测定误差较大、线性较差且灵敏度低，其他成分也会与铜离子形成络合物，干扰结果的准确性。

(5)甘油激酶法所使用的酶只与溶液中的甘油特异性地反应，专一性强，很少受样品中所含杂质的影响，且操作简单、灵敏度高、重复性好、精密度好且测定速度快，非常适合于成分比较复杂的样品中的甘油检测，但所需试剂昂贵，不利于工业应用和大量样品的检测。

(6)红外光谱法具有高效、快速、成本低、无损且无污染等优点，但是该法需要精密的仪器设备和复杂的数据模拟处理，只适于在液体表面的测量，难于测量深处的水溶液内部，而且该法易受外来因素的影响，测量精度很低。

3展望

上述传统的甘油检测方法多数结合紫外分光光度、红外光谱等光学技术手段对甘油进行检测，检测技术手段单一，在一定程度上限制了它们在生化生产上的应用，因此需要对甘油的检测方法做进一步的改进、创新和完善。我们认为，甘油的检测技术在以下几方面将会取得很大的发展：

(1)将会进一步与电化学、拉曼光谱以及荧光等其他检测技术结合，扩展并完善甘油检测的手段方法；

(2)多种甘油检测方法将会结合与融合，实现多角度、立体式联合检测，更准确地反映出样品中的甘油含量；

(3)各种具有不同尺寸、形状、复合性能的微观纳米粒子不断涌现，有望融合到检测甘油的方法中，极大地提高检测方法的灵敏度与检测限；

(4)随着科学技术的发展，许多器件制作工艺在不断完善，预计在不久的将来，会有灵敏度更高、检测的专一性更强、测定速度更快、测定准确度更精确的检测技术和检测仪器出现；

(5)随着计算机互联网云技术的高速发展，将会实现待测样品中甘油含量的连续、遥控与实时在线监测。

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Research advances on detection technology of glycerol

FENG Dong,LI Qiu-shun*,WANG Bing-lian,SHI Jian-guo

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶Glycerol is an important industrial raw material and has been broadly applied in national defense, chemical industry, paint, food, daily chemicals, pharmacy, pesticide, biological products, etc. It has an important effect on output control of fermented products, diesel quality control, cosmetics freshness and the availability of frozen blood. We survey the application advances of recent glycerol content detection methods such as malaprade oxidation, Cu2+colorimetry, enzymatic catalysis-spectrophotometric methods. We suppose future development trend of its detection method is combination of conventional detection technologies with new nanometer materials and new detection technology, further improvement of specificity and sensitivity of its detection, instrumentation, automation, miniaturization and rapidness of its content detection, and continuous, remote, real-time and online monitoring for its content with the aid of Internet and cloud technologies.

Key words∶glycerol; detection method;progress

中图分类号：O648.14；O657.39；O433.1

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)02-0057-07

作者简介：冯东(1972-)，男，副研究员，研究方向为生物传感器的制备和分析。*通讯作者，李秋顺(1969-)，男，博士，研究方向为光电生化分析。Email:lishun1688@126.com

基金项目：国家自然科学基金 (61340032，91123029)；国家高技术研究发展计划(863计划) (2012AA021201)；山东省自然科学基金 (ZR2012CM029)；山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX02602)；山东省重点研发计划(2015GSF117024，2015GSF121047)

收稿日期：2015-08-20

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.011