DNA组装技术的研究进展

刘永军

（上海交通大学生命科学学院 上海 215036）

DNA组装技术的研究进展

刘永军

（上海交通大学生命科学学院 上海 215036）

合成生物学具有巨大发展潜力，作为一门新兴学科，它有效结合了科学与工程，在生物制药、环保、农业、物质能源等方面发挥了巨大的作用。而DNA组装技术是合成生物学中的关键技术，DNA组装技术研究进展极大的限制了合成生物学的快速发展本文在简述合成生物学发展的基础上，基于DNA组装的基本理念，对主要DNA组装技术发展情况及其在合成生物学发展中的意义及应用进行了研究，为DNA组装技术的应用发展提供参考与借鉴。

合成生物学 DNA 组装技术 研究进展

DNA组装技术是实现合成生物学各种目标的重要环节及关键性步骤。随着基因合成技术的不断发展，采用基因合成的成本也在不断的降低，其可行性也得到了大幅度的提升，人们通过研究探索利用合成基因组合成细胞的期望也进一步增加。现阶段，对于各国设计合成基因组的水平仍不能满足我们对合成实用生物组件的需要。关于合成生物学的大量研究工作仍然停留在人工合成组合生物组件和模块化建设阶段。显然，DNA组装技术是限制合成生物技术快速发展关键环节。所以研究DNA组装技术对合成生物学的发展至关重要。

1　合成生物学简介

法国物理化学家Stephane Leduc于1911年在《生命的机理》一书中首次提出合成生物学。“合成生物学”对生物技术产业的发展起到了空前的影响，并带来了前所未有的改变，因此被认为是可以改变世界的十大新技术之一［1］。基于经典基因工程和代谢工程，合成生物学对工程、电子、计算机科学、数学等多学科的内容进行了整合，深化了人类对人细胞机制、物种改变、控制神经网络和演化的认知，还能对DNA进行重新编程，实现一些特殊的生物功能［2］。

合成生物学是结合了科学与工程的的新领域。它由分子生物学、基因组学、信息技术和工程合并，产生一套新的工具和方法，并通过在需求人（目标）的研究和应用，合成生命功能的生物分子（组件、模块或组件）、系统甚至细胞，采用“自上而下”集成系统的生物学分析研究策略，为生物学研究提供了一个“自下而上”的合成策略及正向工程方法。人们利用基本的生物学元件设计和构建了基因开关、振荡器、放大器、逻辑门、计数器等合成器件，实现对生命系统的重新编程并执行特殊功能。

2　DNA组装技术

DNA组装的基本思想是将两个分子凝聚衔接和片段组装方式。DNA分子的链接内，如同砖堆积成房子。由此可知，狭义上的“分子水泥”就是DNA连接酶，而广义上是指创建两个分子之间的重叠区域，通过连接或聚合。

Khorana等早在上世纪六七十年底就研究了寡核苷酸合成技术，这一举动为基因在化学界的打下了基础。1970年，Khorana等［3］通过酵母丙氨酸tRNA基因编码的合成，实现了人类历史上第一次通过人工对基因进行合成。然后，大量的蛋白质编码基因以大肠杆菌为载体实现了合成。早期的研究表明：化学合成基因的有效性和实用性是可以得到充分肯定的。在1980年代中期，研究出了超过100bp的寡核苷酸，这一研究极大的推动了基因合成技术的发展及进步。通过采用连接酶介导法、FokI法等，寡核苷酸被组装成具有功能的基因。但是，早期的合成技术仍然存在着只能合成小于1 kb的DNA片段的不足。

基于两步PCR，Kodumal通过使用该DNA合成法，合成了大量具有重叠区域的寡核苷酸基因。采用合成寡核苷酸基因的方法包括两个链，所有的寡核苷酸重叠在PCR反应体系反应时，采用寡核苷酸片段作为链，通过扩增长度来实现合成基因。

功能基因主要由三部分组成，包含核糖体结合位点（RBS）启动子、开放阅读框（ORF）和终止子。当然还包括一些其他元素，如处在上游、下游的调整区域、RNA折叠区等等，可是这些元素都不是功能基因所必须具备的。将这些独立的元素结合到一个功能基因是需要进行排序的，首先是启动子ORF，然后是终止子ORF。BioBrickTM组装法正式由Knight发明的一种有效的方法。在序列两端加入单个元素可以有效的低成本，简单和采用固定模式的酶切连接方法将所有元素综合到一个系统中去。通过BioBrickTM方法构建的生物模块，能够在各个地方通用，实现资源共享。在过去的十年里，这种方法对提升合成生物学构建生物组件起到了巨大的推动作用。

作为合成生物学的最基础部分，实现功能基因的成功组装仍然是最基础的步骤，目前主要的研究多集中在对若干个基因组的顺序实验，以实现具有特殊功能的生物基因。例如，调节网络—通过iGEM项目实现，生物燃油的生产—采用代谢工程等。在建立生物途径的过程中，存在于基因之间的序列痕迹是不会对基因的功能的效用产生明显的影响的。因此，BioBrickTM组装方法是非常适用于基因组装成的。但由于该方法存在耗时长，存在序列限制的缺点，因此只适合小规模途径的建立。

3　总结与展望

DNA 组装技术正处在一个快速发展阶段，不同尺度的DNA组装方法都会相继诞生，这些方法均有各自的优点，但从目前的研究结果来看，还没有一个普遍性实用的组装方法可以满足序列依赖、无痕或标志跟踪不受序列位置的影响效果的实现，在这个过程中我们需要根据预设的顺序快速并行装配，并使用在大规模的合成基因组中。我们可以通过几项技术串联使用，充分利用不同的组装技术有不同的适用特性这一特征。DNA合成将会更加快速、高效而廉价。大规模的基因、基因组的合成将成为现实。DNA 组装技术的应用将越来越广泛，促进合成生物学的快速发展。

［1］ Huang G T.10 emerging technologies that will change your world ［J］.Technology Review，2004，107（1）：32-50.

［2］ Singh V.Recent advancements in synthetic biology：current statusand challenges［J］.Gene，2014，535（1）：1-11.

［3］ Itakura K，Hirose T，Crea R，et al.Expression inEscherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.Science，1977，198（4321）：1056-63.

Q-3

A

1674-2060（2016）05-0342-01