一种高效简便的原代神经元培养方法

张涛，胡怀强，王旭辉，牛兵，陶珍，曹秉振

·论著·

一种高效简便的原代神经元培养方法

张涛1、2，胡怀强1，王旭辉3，牛兵1，陶珍1，曹秉振1

目的：建立一种简便高效的原代神经元培养方法。方法：出生12 h内的Wistar乳鼠，分离皮质后剪碎，0.25%胰酶消化30 min，漂洗后轻柔吹散细胞，过滤后1 000 rpm离心5 min，弃上清，加接种液吹匀后过滤，静置3～5 min，取上层液体计数并接种。接种后4、45、96 h全量换液，之后每3 d半量换液1次。培养第5天评估神经元，NSE染色、NMDAR1染色和台盼兰染色。结果：神经元纯度高（＞95%），死亡率低（＜5%），细胞形态好，交联充分，背景干净。结论：利用新生大鼠皮质建立了高质量、高产量、简便的神经元培养模型。

皮质神经元；原代培养；细胞模型；乳鼠

神经元原代培养是研究神经系统疾病的重要基础模型[1,2]。目前的模型大多存在一些瑕疵，如手术复杂，手术时间长，影响神经元活力；神经元纯度高，但死亡率也较高；价格昂贵，对实验器材及相关试剂要求高[3-5]等。本课题组采用新生乳鼠皮质，建立了一种简单、廉价、高产、高纯度、高成活率、低背景的神经元培养模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与试剂 新生12 h内Wsitar乳鼠，雌雄不拘，购自山东大学实验动物中心。0.25%胰酶（含EDTA）（PYG0015）购于武 汉 博 士 德 公 司 ，Neurobasal-A（108880-022）、B27（17504-044）、glutamax（35050-61）、Hanks’Balanced Salt Solution（HBSS）液（14175-079）、小 牛 血 清（16000-044）购于Gibco公司，DMEM/F12（SH30023）购 于 Hyclone公 司 ，DnaseI（D8071）购于上海联硕公司，抗体NSE（neuron-specific enolase）（SAB4200571）、多聚赖氨酸（P1399）购于Sigma公司，抗体NMDAR1（N methyl D aspartate recptor（ab134308）购于abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 解剖及培养 少量水合氯醛捂鼻麻醉乳鼠，浸入75%酒精，再浸入无菌冰水中约2 min。无菌冰台上迅速完整分离整个脑组织，置于冰HBSS液中漂洗。首先剪去尾侧小脑，再沿矢状线剪开两侧大脑，将脑组织移入另一干净的冰HBSS液中。小眼科镊去除掉皮质下脑干、间脑等组织，完整剥离软脑膜，去除残留血管、嗅球等组织。取出皮质放入接种液PM（plantation medium，10% FBS/DMEM/F12）中，剪碎。将剪碎的脑组织吸入37℃预热的胰酶中37℃消化30 min。将絮状的皮质组织吸入PM液中放置3 min×2次。再将皮质组织吸入吹打液BM（blowing medium，0.2 mg/mL DnaseI/10%FBS/DMEM/F12）中，用塑料一次性无菌吸管轻柔缓慢吹打，吹打前将管口稍微过火钝化，吹打时避免吹入气泡，吹打BM液为米汤状。200目细胞筛过滤后1 000 rpm离心5 min，弃上清后加入适量PM液稍微吹匀后再次200目细胞筛过滤，静置约3 min后取上清液计数细胞密度，计算好接种浓度后添加适量PM液配好接种液。接种量：9.5×104/孔（24孔板），7.0×105/孔（6孔板）。接种后4、45、96 h使用NM（neurobasal meduim，含Neurobasal-A，B27，glutamax，青链霉素）全量换液，每次换液前可用HBSS液轻柔漂洗1次，之后可每3天半量换液1次。

1.2.2 细胞鉴定 培养第5天评估神经元，光镜下观察神经元并行NSE、NMDAR1免疫细胞化学染色和台盼兰染色。免疫细胞化学染色：4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS液漂洗，3%H2O2去离子水10 min，PBS液漂洗后山羊血清封闭液20 min，NSE或NMDAR1孵育4℃过夜，漂洗后生物素标记山羊抗大鼠IgG室温15 min，漂洗后辣根酶标记链霉卵白素室温15 min，漂洗后DAB显色。台盼兰染色：400 μL的2%台盼兰染液/孔（24孔板），室温下12 min，倒掉染液，倒置光学显微镜观察计数。

2 结果

2.1 神经元生长情况变化

接种约12 min左右，大部分神经元即沉底，但贴壁不牢。接种4 h可见少数神经元长出突起，神经元体积较小。接种第1天，大部分神经元长出突起。接种第2天，几乎所有神经元均长出突起，突起较长。部分非神经元细胞、死亡神经元、组织碎屑可在45 h全量换液时去除。换液后神经元纯度高，活力好，背景干净。接种第3天开始，神经元形态基本成熟，体积较前变大。接种第4天神经形态进一步发育成熟，细胞饱满透亮，突起交联充分。部分活力较差的神经元和死亡细胞在接种96 h全量换液时可去除。此后死亡细胞仍贴壁牢，再全量换液无类似明显效果。第5～9天细胞状态无明显变化，可用于相关实验。第10天神经元逐渐衰老，透亮度下降，部分神经元固缩凋亡，见图1。

2.2 神经元状态评估鉴定

接种第5天，神经元特异性标志物NSE染色阳性率＞95%，见图2A；NMDAR染色可见神经元突起细长，交联密布充分，见图2B；台盼兰染色阳性率＜5%，见图1C、D。神经元生长状态好，达到进一步实验要求。

图1 培养的皮质神经元生长情况（光镜，×200）

图2 神经元评估鉴定

3 讨论

神经元的培养模型很多，还有一些实验[6,7]通过诱导其它细胞分化为神经元。

细节的处理是决定神经元培养效果的关键。本研究主要进行了以下调整：①早期全量换液。本课题组研究发现全量换液对细胞活力的影响不明显，而且可以清除活力差的细胞、非神经元细胞和坏死碎屑。要注意操作温柔、快速、一孔一换液，减少干底时间和污染。②换液时间很重要。采用NM液于接种后第4、45、96 h全量换液。能清洁神经元，保持神经元高活力、高纯度、低背景。换液后超过2 d或接种第4天以后，神经元已经贴壁非常牢固，此时全量换液并不能将死亡的神经元全部换掉。常规接种后每3天半量换液无此净化效果。③通过简化实验步骤，减少取材接种时间，提高细胞活力。如胰酶消化后各个步骤均直接采用接种液PM为溶液，采用FBS中和胰酶。④增加离心后的过滤和沉淀。离心后还会有部分神经元缠结成絮状，无法吹匀，过滤弃除。仍有部分团块状的神经元得通过静置去除。

此外还有一些细节问题非常重要。吹打和消化是2个非常重要的因素。笔者的经验是：采用含EDTA的胰酶，利于吹散神经元；每次接种神经元之后15 min在光镜下观察神经元状态。如果团块细胞多，说明消化不够，需要增强消化时间或者胰酶浓度；如果有大量组织碎屑，说明消化过头；如果非神经元细胞过多，说明解剖不够干净准确。数次调整后摸索出适宜的消化方法和固定的吹打模式。不需要将所有的皮质组织都吹散利用，只需吹打出适当高活力的神经元即可。本组1只乳鼠的2个皮质可收集约300～400万个神经元。另外，接种密度也是重要的因素。接种密度过大会影响神经元生长，导致部分神经元死亡。接种的时候应该提前计算并混匀好接种液[8]。

本课题组培养的神经元生长发育较其它报道的模型快[9]，1 d左右大多数神经元都长出突起，3 d左右神经元基本成熟，10 d左右出现衰老[10]。考虑可能和采用乳鼠皮质培养，较孕鼠神经元发育较快有关。另外，通过全量换液的过程，富集了高活力和生长发育快的神经元可能也是一个原因。

本研究通过简单的乳鼠皮质以及简便的培养过程，培养出高质量原代神经元，为类似的实验研究提供了参考，尤其是有关神经元死亡率相关的实验。

[1]Beaudoin GM 3rd,Lee SH,Singh D,et al.Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex[J].Nat Protoc,2012,7:1741-1754.

[2]Giordano G,Costa LG.Primary neurons in culture and neuronal cell lines for in vitro neurotoxicologicalstudies[J].Methods MolBiol,2011, 758:13-27.

[3]姜茜,姜玉武,王静敏,等.一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定[J].北京大学学报(医学版),2009,41:212-216.

[4]张小娟,李廷玉,刘友学,等.简易大鼠海马神经元原代培养方法及神经元兴奋性检测[J].南方医科大学学报,2010,30:2080-2083.

[5]康国创,刘文博,尹丽鹤,等.一种改进的高密度大鼠皮层神经元培养方法[J].中华神经外科疾病研究杂志,2009,8:417-420.

[6]何主强,杨国平,赵洪洋,等.Nogo-A受体在早期神经元细胞分化过程中的表达[J].神经损伤与功能重建,2015,9:95-97.

[7]戴锟,孙晓阳.成纤维细胞向神经元转化的研究进展[J].神经损伤与功能重建,2015,9:59-61.

[8]杨传豪,赵冬,刘祺,等.新生大鼠皮层神经元体外无血清原代培养[J].重庆医学,2014,43:3901-3903,3906.

[9]余华荣,杨贵忠,杨俊卿,等.大鼠皮层神经元原代培养方法的改进[J].重庆医科大学学报,2007,32:392-394,401.

[10]王旭辉,张岫竹,王伍超,等.大鼠下丘脑神经元培养的新方法[J].第三军医大学学报,2009,31:1709-1711.

（本文编辑：唐颖馨）

An Efficient and Convenient Model of Culturing Primary Neurons

ZHANGTao1、2,HUHuai-qiang1,WANGXu-hui3,NIUBing1,TAOZhen1,CAOBing-zhen1.

1.GeneralHospitalofJinanMilitaryArea,Jinan 250031,China;2.No.303Hospital ofChinesePeople'sLiberationArmy,Nanning530021,China;3.DapingHospital，ResearchInstituteofSurgeryThirdMilitaryMedical University,Chongqing400042,China

Objective:To establish an efficient and convenient model of culturing primary neurons.Methods: Firstly,the cortex of newborn Wistar mice younger than 12 hours old was thoroughly separated.And then the cortex was digested by 0.25%tyrisin for 30 min after cutting into pieces.Cells were rinsed,blew and centrifuged at 1000 rpm for 5 min after filtering.The supernatant was abandoned,and the resultant was added with plantation medium,gently blew and filtered.After standing for 3～5 min,the supernatant liquid was withdrawn in order to perform a count on the cells.The medium was replaced in full at 4 h,45 h and 96 h later after seeding and then the medium could be replaced in half every 3 days.At day 5 of culture,the neurons were evaluated by NSE,NMDAR1 and trypan blue staining.Results:The purity of neurons was over 95%and the mortality rate was less than 5%.The morphology of neurons was excellent,effectively crosslinking,and the background was clean.Con⁃clusion:Ahigh-quality,high-yield and simple neuronal culture model was established using neonatal rat cortex.

cortical neurons;primary culture;cell model;newborn rats

R741；R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.001

1.济南军区总医院济南 250031

2.解放军第303医院南宁 530021

3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所重庆 400042

十二五全军重点项目No.BWS11J062

2016-01-20

曹秉振cbzxia2011@163. com