肾组织B淋巴细胞浸润及其异位淋巴样组织形成在狼疮肾炎诊治中的意义

龙康霞，董光富，张　晓，张光峰

(广东省人民医院风湿免疫科 广东省医学科学院 华南理工大学，广州 510080)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：225- 231

随着B细胞靶向治疗成功应用于难治性系统性红斑狼疮(systemic lupus erythenlatosus，SLE)，B细胞在SLE发病机制中的地位日益受到重视，但B细胞参与SLE发病机制的具体环节仍未完全清楚[1]。B淋巴细胞通过自身抗体依赖机制参与SLE发病过程已得到公认，近年来研究提示，B淋巴细胞通过非抗体依赖机制参与SLE发病过程可能更重要，但具体机制尚不清楚[2- 4]。已有研究提示，慢性自身炎症性疾病或自身免疫病受累组织器官中可出现B细胞异常聚集及其密切相关的异位淋巴组织(ectopic lymphoid organ，ELT)样结构形成，尽管其结构及组成特点有别于典型次生淋巴组织器官。受累组织局部形成的ELT可能充当着全身免疫反应最前沿阵地，局部B细胞浸润及其相关ELT形成可能是B细胞参与自身免疫病并发组织器官损害的非抗体依赖机制之一[5- 7]。B细胞浸润及其相关ELT形成在人狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)肾组织是否存在及其在LN发病机制中的作用目前尚未完全清楚。为此，本研究通过光镜病理观察LN的肾组织中B细胞浸润及ELT形成情况，并观察ELT形成模式及其与LN临床病理联系，以了解B细胞浸润及ELT形成是否参与了LN发生发展过程及其在LN诊疗中临床意义，为LN发病机制及临床治疗学研究提供新思路。

资料与方法

临床资料

收集2009年1月至2013年12月在广东省人民医院风湿免疫科住院的LN患者。本研究得到广东省人民医院伦理委员会批准。

入选标准：(1)符合美国风湿病学院(American College of Rheumatology，ACR)1997年SLE分类标准；(2)LN诊断应该同时满足下列条件：①抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)阳性并肾活检病理有LN典型特征；② 确诊SLE患者，并满足下列条件之一：24 h尿蛋白>0.5 g；或尿蛋白定性≥+++；或尿红细胞数>5个/高倍镜视野(high power fields，HPF)、尿白细胞数>5个/HPF并且排除尿路感染；或管型(红细胞、血红蛋白、颗粒或混合管型)；(3)光镜下观察肾小球数目10个以上；(4)有完整的病历资料。

排除标准：(1)年龄≥70岁；(2)诊断为其他结缔组织病引起的肾损害；(3)乙型肝炎相关性肾炎；(4)严重心肺功能不全者；(5)并发感染者。

LN治疗6个月时治疗反应主要观察有无缓解，包括完全缓解(complete remission，CR)和部分缓解(partial remission，PR)。CR与PR标准参照国际LN治疗效果判定标准。

方法

收集的LN患者肾活检标本常规行光镜+免疫荧光检查。肾组织中T、B淋巴细胞和树突状细胞(dendritic cells，DC)表达及其分布情况采用免疫组织化学法。免疫组织化学着色结果判断：CD3+、CD20+及CD21+表达均为棕色颗粒，CD3+表达定位于细胞膜和(或)胞质，CD20+表达定位于细胞膜，CD21+表达定位于细胞膜。

根据有无CD20+细胞表达将肾组织标本分为B细胞组和非B细胞组。根据CD20+细胞、CD3+细胞和CD21+细胞共表达模式差异，再将肾标本分为四类[8]。(1)0类：CD20+细胞无表达，或仅有CD3+细胞表达，无CD21+细胞表达；(2)1类：CD20+细胞表达，伴或者不伴CD3+细胞表达，若同时有CD3+及CD20+细胞表达时两者呈散在分布，无CD21+细胞表达；(3)2类：CD20+细胞及CD3+细胞均有表达，且两者呈区域分布，但无CD21+细胞表达，形成非典型ELT；(4)3类：CD20+细胞及CD3+细胞表达，且两者呈区域分布，同时有CD21+细胞表达，形成典型ELT。

肾组织中T、B淋巴细胞和DC计算方法，参照文献[9]。LN肾组织活动和慢性损害指数参照1984年Austin等[10]提出的计分方法。

统计学处理

结　　果

临床特点

入组LN病例89例，其中男性11例，女性78例，男女比例1∶7.1；年龄1～55岁，平均(33.2±12.9)岁；病程4～37个月，平均(18.6±10.3)个月；系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)4～28分，平均(16.8±7.0)分；抗dsDNA定量297.6(98.3～630.5)IU/ml；尿蛋白2 989.8(802.5～10 900)mg/24 h；血尿素氮3.5～16.3 mmol/L，平均(8.2±4.2)mmol/L；血肌酐36.8～204 μmol/L，平均(105.1±54.4)μmol/L。所有患者均接受开始甲泼尼龙500～1 000 mg/d冲击3 d，继之泼尼龙1 mg/(kg·d)或等效量甲泼尼龙，规律减量至最少维持量5～15 mg/d。其中59例患者接受1982年Austin提出的环磷酰胺冲击方案，其中12例因胃肠道反应不耐受或骨髓抑制改用酶酚酸酯，30例起始接受酶酚酸酯750 mg每天2次诱导治疗。

肾脏组织病理类型及淋巴细胞浸润分布特征

HE染色光镜下淋巴细胞分布以肾间质为主共77例(86.5%)，肾小管周围为主9例，肾小球周围为主3例；淋巴细胞呈区域分布共51例(57.3%)，但均无典型淋巴滤泡形成；肾脏病理活动性指数(activity index，AI)评分3～19分，平均(10.7±4.8)分；慢性指数(chronic index，CI)评分1～4分，平均(3±1)分。

与非B细胞组比较，B细胞组平均病程较长且治疗6个月CR率明显降低(t=2.185，P=0.045；χ2=2.384，P=0.047)；两组间其他临床资料差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。

依据免疫荧光特点将肾组织B细胞、T细胞和滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells，FDC)浸润分布模式分为0、1、2三类ELT模式，无3类。0类20例(22.5%)，1类18例(20.2%)，2类51例(57.3%)；其中2类有36例为Ⅳ型LN，12例Ⅲ型，3例Ⅴ型。在0～2三类中，相对应各类LN患者病程比较差异有统计学意义，其中2类病程比0类和1类长，比较差异有统计学意义(P=0.017和P=0.039)，0类与1类之间病程比较差异无统计学意义(P=0.280)；而肾脏AI在2类与0类之间比较差异有统计学意义(P=0.047)，在1类与2类之间差异无统计学意义(P=0.056)，而SLEDAI评分、肾脏CI、补体C3、24 h尿蛋白、抗dsDNA水平等三者之间差异无统计学意义(图1，表2)。

Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型LN三组间每HPF下CD3+、CD20+CD3+细胞数差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同LN病理类型之间CD20+、CD3+和(或)CD3+CD20+细胞数之间比较，CD20+细胞数三组之间差异无统计学意义(P=0.317)。与Ⅴ型LN比，Ⅳ型CD3+细胞数、CD3+CD20+细胞数均明显增多(P=0.000和P=0.005)，Ⅲ型CD3+细胞数明显增多(P=0.005)(表3)。

分组男性[n(%)]年龄(岁)病程(月)尿蛋白#(mg/24h)血肌酐(μmol/L)补体C3(mg/L)抗dsDNA定量#[IU/ml(P25，P75)]B细胞组(n=69)8(116)306±122218±9936895(15687，86865)1072±5854769±26182825(1156，4186)非B细胞组(n=20)3(150)415±12998±6217856(9658，35165)983±4493458±8973125(1356，4625)χ2/t/H值0786-15422185-067902770966-0341P值0294014400450497078503500733分组LN病理WHO分型∗ⅢⅣⅤCI评分(分)AI评分(分)SLEDAI评分(分)6个月LN⁃CR∗6个月LN⁃TR∗B细胞组(n=69)16(232)42(609)11(159)31±16103±47173±7944(638)59(855)非B细胞组(n=20)4(200)14(700)2(100)22±10109±51153±3018(900)19(950)χ2/t/H值1450559056900822384126P值018905840578062400470212

dsDNA：双链DNA；LN：狼疮肾炎；AI：活动性指数；CI：慢性指数；SLEDAI：系统性红斑狼疮病情活动度；TR：总缓解；CR：完全缓解

图1根据肾组织CD20、CD3、CD21免疫组化特征分类(×400)

Fig1Classification of ELT formation patterns based on CD20, CD3 and CD21coexpression by immunochemistry (×400)

分别在连续切片上进行CD20、CD3、CD21染色；0类无CD20+细胞表达，仅CD3+细胞散在分布，无CD21+细胞表达；1类可见CD20+细胞、CD3+细胞呈散在分布，无CD21+细胞表达；2类CD20+细胞、CD3+细胞表达，且两者呈区域分布，无CD21+细胞表达

ELT类型年龄(岁)病程(月)尿蛋白[mg/24h(P25，P75)]血肌酐(μmol/L)补体C3(mg/L)0类(n=20)415±12998±6215468(8569，25786)983±4493458±8971类(n=18)314±133164±7820316(9566，39565)1005±4264408±27882类(n=51)301±124244±10223655(7556，95606)1114±6924995±2676F/H值11273899112300910529P值03520045035309140600ELT类型抗dsDNA定量[IU/ml(P25，P75)]CI评分(分)AI评分(分)SLEDAI评分(分)0类(n=20)1969(796，7968)53±2258±26153±301类(n=18)1159(726，6856)62±1383±41146±1002类(n=51)2156(1155，5657)56±20125±51190±65F/H值0133044229861707P值0936065200470310

ELT：异位淋巴样组织；SLEDAI：系统性红斑狼疮疾病活动指数；AI：活动性指数；CI：慢性指数

Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型三组LN患者肾组织ELT形成类型构成比差异具有统计学意义(χ2=28.04，P<0.000 1)。Ⅲ、Ⅳ型两组间、Ⅳ、Ⅴ型两组间、Ⅲ、Ⅴ型两组间ELT类型构成比比较差异均具有统计学意义(χ2=10.78，P=0.004 6；χ2=28.29，P<0.000 1；χ2=5.07，P=0.079 3)。在Ⅲ型和Ⅳ型LN患者中可见2类分布的ELT比例较0或1类分布比例明显增多(Ⅲ型：P=0.013；Ⅳ型：P=0.001)，而1类与0类分布比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；而Ⅴ型LN组中，三类分布比例两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

讨　　论

研究认为异位淋巴样组织组成中最重要部分是包括呈区域分布的T淋巴细胞、B淋巴细胞以及联结两者的抗原递呈细胞FDC，而目前研究提示，B淋巴细胞可能是结缔组织受累组织中ELT生发中心更重要的组成细胞[11]。有关ELT在结缔组织病相关靶器官损害中的作用及其机制，近年来研究主要集中于干燥综合征患者的唇腺组织、类风湿关节炎患者的滑膜组织、炎症性肌病患者的肌肉组织以及SLE动物模型的肾组织等[12- 13]。而ELT在人SLE并发LN中作用及其机制研究尚未见文献报道。

WHO病理分类细胞数/HPFCD20+#CD3+CD3+CD20+Ⅲ型(n=21)128(49，185)318±75455±174Ⅳ型(n=53)146(39，218)343±57558±176Ⅴ型(n=15)89(25，165)180±47248±78F/H值2299107985622P值031700010016

HPF：每高倍视野。#以中位数(P25,P75)表示

表4　不同病理类型LN肾组织ELT形成模式Table 4　ELT formation patterns in the renal tissues withdifferent WHO pathological classification in LN patients　(n)

LN：狼疮肾炎；ELT：异位淋巴样组织

LN肾组织B淋巴细胞浸润临床意义

本研究提示，B淋巴细胞在LN肾组织异常聚集可能在促进ELT形成及其LN疾病进展中有独特作用。本研究中77.5%的LN病例肾组织中有B淋巴细胞浸润，且有B细胞浸润组病程较无B细胞浸润组明显延长，尤其有B淋巴细胞和T淋巴细胞局部聚集(2型ELT)的LN病程较无B细胞聚集的LN平均病程明显延长。且有B细胞局部聚集的LN对糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗反应较差。提示LN肾组织有无B细胞聚集与LN病程相关，B细胞在肾组织异常聚集可能与LN治疗反应差相关。Steinmetz等[14]对32例LN及16例抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)血管炎相关性肾炎的患者进行研究，选取2例初次活检无CD20+B淋巴细胞表达和1例仅有散在分布的CD20+B淋巴细胞及CD3+T淋巴细胞表达的LN患者的肾组织，1例仅有散在分布的CD20+B淋巴细胞及CD3+T淋巴细胞表达的ANCA血管炎相关性肾炎的患者肾组织，共4例在初次肾穿后间隔23～116个月之间进行第二次肾活检，发现虽然上述患者规律使用激素联合传统的免疫抑制剂治疗，原来仅有散在分布的T、B淋巴细胞浸润的肾组织第二次肾活检时为T、B淋巴细胞呈局灶性分布，且原本无CD20+B淋巴细胞浸润的肾组织出现了CD20+B淋巴细胞的表达，提示传统的药物治疗可能对LN肾组织浸润的B淋巴细胞无清除作用，而活动性LN或难治性LN患者，可能会随着疾病发展时间的推移，B淋巴细胞逐渐出现递增地在肾组织聚集，并可能与T淋巴细胞、FDC相互作用形成异位淋巴样组织，进一步导致肾组织的慢性肾损伤及LN病情的反复。阻止或尽早清除LN肾组织中B淋巴细胞异常聚集可能是有效治疗某些难治性LN重要环节，近年来CD20单抗用于某些难治LN取得疗效可能依据如此。

LN肾组织B淋巴细胞浸润模式临床意义

本研究显示，LN肾组织中淋巴细胞浸润呈局灶分布(2类结构)共51例(57.3%)，但未观察到典型淋巴滤泡样结构形成，肾组织淋巴细胞浸润以肾间质为主，共有77例(86.5%)。Shen等[15]研究发现，192例LN组织中均无CD21+细胞表达；而Chang 等[16]对64例LN研究指出4例(6%)肾间质出现以CD20+B细胞为中心，外周CD3+CD4+T淋巴细胞及CD138+浆细胞围绕，并且有表达CD21+的DC形成淋巴生发中心样结构。Steinmetz等[14]对32例LN及16例血管炎相关性肾炎的患者进行研究，4例LN及1例ANCA血管炎相关性肾炎肾组织中有呈区域性分布的CD20+B淋巴细胞和CD3+T淋巴细胞并同时有CD21+为标记的FDC表达。

本研究中LN肾组织中Ⅳ型LN中CD3+细胞数和(或)CD20+细胞数均明显高于Ⅴ型，提示Ⅳ型LN肾组织内局部自身免疫炎症反应强度较Ⅴ型明显增加。另外，不同病理类型之间比较，ELT分布特征不同，相较Ⅴ型LN，Ⅲ型和Ⅳ型LN更多见2类ELT分布。Shen等[15]对大样本LN的肾组织研究指出，B淋巴细胞浸润组以Ⅳ型LN居多，与本研究结果类似。

综上所述，大部分LN患者肾组织主要在肾间质可出现B细胞异常浸润及其相关ELT形成，出现B淋巴细胞异常浸润的LN患者病程较长，且对GCs联合免疫抑制剂治疗方案反应较差，ELT多见于WHO Ⅳ型LN肾组织。B淋巴细胞异常浸润及其ELT形成可能参与了难治性LN发病机制并与LN预后差相关。阻断B细胞在肾组织异常聚集可能是难治性LN治疗学研究中重要靶点。

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