DNA条形码的研究现状概述

姚鹏程

(华东师范大学生命科学学院 上海 200241) 安 梅 (上海市南洋模范中学 200032)

随着人类对于生物多样性认识的不断加深，生物多样性的保护和持续利用成为世界性的重大需求，快速的物种鉴定也就越来越成为迫切的现实需要。但是，由于传统分类学本身存在的固有局限以及传统分类学工作者人数的不足，经典的物种鉴定渠道严重制约着生物多样性的有效保护和合理利用，DNA条形码技术随即应运而生[1]。该技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份的识别系统，用以实现对物种的快速自动鉴定[1]。简单地说，DNA条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而鉴定某个未知的物种或者发现新种[2]。该技术一经提出就受到各国分类学家重视，迄今经过13年的研究，DNA条形码已经得到了极大的发展，即已经从最初的筛选片段和获得片段信息发展到在多个学科领域的广泛应用。不过，随着研究的不断深入，利用现有DNA条形码进行特定物种鉴定的局限性也逐渐显现。

1 DNA条形码的研究现状

1.1 动物DNA条形码的研究现状 Hebert等[1]选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)的一段序列在动物界门、目、种等不同分类水平上进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提议其中约650bp长的一段序列作为动物的标准DNA条形码。此提议出来后，便不断有研究对其适用性进行验证。研究表明，所提议的片段可在物种水平上对绝大多数动物类群进行鉴定, 还能较准确地区分近缘类群。但是，由于动物界物种丰富度极高，截止2014年仅已知种类估计就有200万种，其中大量物种的DNA条形码数据尚未报道，目前对于动物DNA条形码的研究依然集中于标准条形码COI的物种片段数据的收集和分析。

1.2 植物DNA条形码的研究现状 相较于动物，植物线粒体基因组本身的一系列特点，使得以其作为植物的DNA条形码并不具备明显的优势。植物线粒体基因组的相关特点主要包括：①基因组较大；②不同类群间因重复、插入或缺失现象等造成序列长度变异很大(300～2000kb)；③存在大量短而分散的重复序列(50～1000bp)；④重复序列引起的基因重组和基因突变会产生变异[3]；⑤基因组丰度较低，其提取和纯化相对困难等。因此，人们把目光投向具有单亲遗传特性、分子量小且极少发生重组的叶绿体基因组，使之成为植物DNA条形码研究的首选。研究者对各种候选片段进行了筛选, 涉及的片段主要分布在叶绿体基因的编码区(rbcL、matK、trnL、accD、rpoC1、rpoB和ndhJ 等) 和间隔区(trnH-psbA、trnK-rps16、rpl36-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD、trnL-F、psbK-psbI和atpF-atpH等)[4]。至2009年，国际生命条形码联盟植物工作组已确定将rbcL 和matK作为植物的核心条形码，此后，由于叶绿体基因间隔区trnH-psbA以及核基因ITS也具有相对较好的物种分辨率，又将这2个片段作为植物的补充条形码。但在一些研究中发现，这四个条形码片段仍不能解决物种鉴别问题.例如,杨培等[5]用这4个候选片段对黄精属(Polygonatum)药用植物进行DNA条形码评价，得出的结论是4个推荐的条形码片段单独或者联合均不适合黄精属药用植物的物种区分，因而提出重新筛选新片段的建议。国内外学者还将目光投向超级条形码(super barcoding，即以叶绿体全基因组作为DNA条形码)以及微型条形码(mini barcoding，即比标准条形码更短的DNA片段用于区分物种的序列)，以期解决疑难类群的物种区分问题。

1.3 微生物DNA条形码的研究现状 由于微生物形态结构简单，形态特征受外界环境影响很大，导致微生物的形态鉴定存在很大的困难。真菌在人们生产生活中应用范围广，经济价值高，因此国内外学者对于微生物的DNA条形码研究侧重于真菌。目前研究者主要是将真菌的DNA条形码研究聚焦在线粒体基因COI和核基因ITS上。DNA条形码技术应用于微生物分类研究，已发现了大量的隐种甚至隐属。例如，Seifert等[6]对青霉属(Penicillium) 的58个物种的370余份样本的COI序列进行分析，发现青霉属可能包含4个属；Nguyen等[7]利用COI 序列发现锤舌菌属(Leohumicola) 的3个新种。科学家估计全球约有150万种真菌，而目前被发现命名的还只有大约10万种，因此今后相当长的一段时间内，真菌DNA条形码的研究将一直致力于新种新属，甚至更高分类等级的发现和记录。

1.4 DNA条形码的应用现状 DNA条形码技术的主要应用目标是快速准确地识别和鉴定物种，这里不再赘述。除此以外，该技术在生态学、进化生物学、系统发育学，区系学，生物多样性保护等学科中的应用也相当广泛。裴男才[8]探讨了DNA条形码在进化生态学中的作用，认为DNA条形码可量化动物取食特征和种子传播交互网络，用以评估每种食果动物对不同小生境中种子雨的贡献。González-Varo等[9]利用DNA条形码检测到不同食果动物选择性地取食不同果实或种子类型, 从而在植食性特征和种子凋落格局之间探讨动植物协同进化特征。葛学军[10]认为通过DNA条形码的数据积累, 能够构建高精度宏系统发育树，开展精细尺度的植物系统发育区系学研究。向小果等[11]提出在系统发育学中可以用被子植物种系发生学组Ⅲ(APG III)作为系统发育骨架, 然后利用DNA条形码片段进行系统发育分析，从而开展生物地理格局、群落系统多样性等方面的研究。周世良等[12]认为DNA条形码技术在保护生物学中可用于确定珍稀濒危物种与其他生物的关系。另外，利用DNA条形码技术可以确定哪些动物是花粉和种子的有效散布者[9]。

2 DNA条形码的局限性

2.1 物种本身遗传、分化特性造成的局限性 当种内DNA序列变异速率远小于种间变异速率时，种内个体间遗传差异与种间遗传差异就能显著区分，从而形成遗传差异鸿沟(DNA barcoding gap)，这是鉴定两个不同物种的理论依据。如果种内个体间遗传差异与种间遗传差异之间不存在这个鸿沟，表明相关物种间界限不明显，通过DNA条形码进行鉴定就无能为力。对于植物而言，由于其多倍化、杂交和辐射进化等多种因素的影响, 利用现有的DNA条形码常常表现为遗传差异鸿沟不明显甚至不存在，因而不能对物种进行精确的鉴定。动物物种界限相对清晰，并具有特有的标准条形码(COI)，但是不同种系间线粒体基因水平转移以及近缘物种共享线粒体多态性现象加大了物种的鉴定难度，一定时期的环境变化导致DNA 序列突变加快也会影响鉴定结果[13]。对于真菌而言，种属差异很大、总数庞大、基因序列的变异度大、很多通用的DNA条形码序列被多个内含子干扰给鉴定工作带来了更多不确定的因素。此外，条形码需要首先对凭证标本进行鉴定，由于真菌形态上难于鉴定，目前每个属种都是用部分具有代表性的菌株进行相关鉴定，致使DNA条形码在此方面的鉴定中也会出现无能为力的状态。

2.2 形态学种与分子鉴定结果不一致 由于形态性状的平行进化或者趋同进化以及隐种的存在等原因，依据形态学特征确定的物种与依据DNA条形码鉴定的结果之间有时会相互矛盾。一部分形态特征相似的直翅目昆虫其系统发育分析结果与形态学研究结果不一致；温带卵胎生的海水鱼条平鲉(Sebastestrivittatus)的形态分类与系统发育位置不一致；形态学方法鉴定贝类与利用核基因片段ITS进行分类鉴定的结果也存在差异。植物界这种不一致也不少，例如榕属(Ficus)[14]、婆婆纳属(Veronica)[15]等。这些现象提示人们，当前乃至今后相当长时期内，期望DNA条形码鉴定取代经典分类学工作是不现实的。

2.3 新一代DNA条形码有待开发 DNA条形码经过十几年的发展已广泛应用于物种鉴定，而在生产实践中人们更期望将其用于对品种进行鉴定；对于珍稀物种保护，人们往往需要了解种群甚至某个个体的准确来源。对于这类问题，目前的DNA条形码基本上无能为力。此外，DNA条形码在实际应用中还会碰到“非标准材料”或样品碎片，如中药材、木制家具、茶叶、卷烟、动物消化残渣，腐败的动物组织等，这些材料内的DNA高度降解，常常并不能够得到完整条形码片段序列，因此存在不能利用现有条形码进行鉴定的情况，需要运用新的技术手段加以解决。