细胞膜信号蛋白Na+/K+ATPase作为强心苷抗肿瘤靶点的研究进展

肖义军 俞如旺

(福建师范大学生命科学学院 福州 300117)

动物细胞膜两侧必须保持一定的Na+/K+离子浓度差才能维持细胞的正常生理活动， Na+/K+浓度差的维持主要依赖于细胞膜上的Na+/K+泵的工作。Na+/K+泵又名Na+/K+ATPase，是一种P型离子泵，它通过水解ATP释放出的能量向膜两侧转运Na+、K+离子，每次循环水解1个ATP分子，可将2个K+转入细胞，同时将3个Na+转出细胞。通常动物细胞要消耗1/3的细胞总ATP供Na+/K+ATPase工作，以维持细胞内高K+低Na+的离子环境，神经细胞需要消耗的ATP更是高达细胞ATP总量的2/3[1]。强心苷类化合物可以特异性地结合细胞膜Na+/K+ATPase，抑制Na+/K+ATPase的离子泵功能。常见的强心苷化合物包括植物来源的哇巴因、地高辛、洋地黄毒苷和动物(蟾蜍)来源的布法林、海蟾蜍毒素等。

新的研究表明，Na+/K+ATPase除了作为离子泵维持动物细胞膜两侧的Na+/K+浓度差外，也是动物细胞膜上的一个非常重要的信号受体[2]。它通过与强心苷结合而活化，激活后的Na+/K+ATPase与肉瘤病毒蛋白(Src)激酶结合引起Src激酶的活化，募集表皮生长因子受体(EGFR)后共同进入信号微结构域膜穴中，组装成不同的信号转导复合体，进一步向细胞内传递信号，引起细胞反应。让人感兴趣的是，不同组织细胞膜上的Na+/K+ATPase与强心苷结合后引起的细胞应答不同。例如，作用于心肌细胞,引起心肌细胞的收缩;作用于血管平滑肌细胞和肾小管上皮细胞,则引起细胞增殖;而作用于肿瘤细胞,则引起细胞凋亡。

近年来的研究发现，强心苷类化合物对人源肿瘤细胞具有极强的杀伤作用，nmol/L浓度级别下就可以强烈抑制人源肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。而目前大多数临床常用的化疗药物其抑制肿瘤细胞生长的浓度级别在μmol/L浓度以上。目前的研究表明，强心苷选择性杀伤人源肿瘤细胞的原因在于物种之间、正常组织细胞与肿瘤组织细胞之间、以及同一个体的不同组织细胞膜上的Na+/K+ATPase均可能存在差异。本文对Na+/K+ATPase的结构以及其作为强心苷抗肿瘤靶点研究的进展做一综述。

1 Na+/K+ATPase的组成和结构

Na+/K+ATPase是一种膜转运蛋白，动物细胞膜上的Na+/K+ATPase主要由起催化作用的α亚基和起调节作用的β亚基组成，每个Na+/K+ATPase分子是由2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体。在肾小管等组织中还存在γ亚基，分子量7～11kD，它的作用可能是调节α亚基与Na+、K+及ATP的亲和力[3]。

研究发现，α亚基有α1、α2、α3、α4四种亚型，依亚型不同分子量介于110～113 kD之间，其中α1亚基的分布最广，它与β1亚基形成的聚合物见于大多数组织的细胞膜上。而α2、α3、α4的分布较有组织特异性，如α2主要分布在心肌细胞、骨骼肌细胞、胶质细胞等的胞膜上，α3在神经组织细胞膜上较丰富，α4目前仅发现存在于雄性生殖细胞胞膜上。α亚基有10个跨膜结构域(M1～M10)，氨基端和羧基端都位于胞内侧，Na+、K+、ATP和强心苷的结合位点都位于α亚基上。β亚基是一种高度糖基化的蛋白，分子量约60kD，其蛋白部分分子量依亚型不同，介于36～38kD之间。它有3种亚型，以β1最常见，β2主要分布在神经组织细胞，而β3则极少见，仅在蛙类细胞中有发现。β亚基仅跨膜1次，其氨基端在胞内，其功能主要是参与维持α亚基的正确折叠，将α亚基从内质网转运到质膜上，并在质膜上稳定α亚基的构型和调节α亚基的活性[4]。

不同物种Na+/K+ATPase的α亚基酸序列有90%以上的相似性，而同一物种不同α亚基之间氨基酸序列的相似性较低，α1、α2与α3之间约有87%的相似性，而α4与其他亚基的相似性仅为76%～78%。亚基的相似性大多来自于跨膜区域、胞内部分和羧基端的氨基酸序列，而差异性多来自于细胞外强心苷结合位点部分、亚型特有区域和氨基端的氨基酸序列。Na+/K+ATPase的β亚基也同样存在着不同物种之间有不同亚型间的差异[5]。因此，不同物种、不同组织、肿瘤细胞与正常细胞对强心苷的反应不同有其结构基础。至今研究过的鼠源肿瘤细胞膜上只有α1表达，而在人源肿瘤细胞膜上α1和α3均有表达[5]。研究显示，细胞膜Na+/K+ATPase的亚基构成并非固定不变，在正常细胞向肿瘤细胞恶变的过程中某些α亚基的表达会发生改变。例如，Sakai等[7]发现人结肠组织在恶变时伴随有α1表达降低和α3表达升高；Suol等[8]研究了29例成神经管细胞瘤的α1和α3的表达状况，发现过半病例中有α1或α3的过表达，1/3病例中两者均过表达；Xu等[9]发现恶变的肝组织和肝癌细胞株的α1表达高于正常肝组织。

人们很早就明确强心苷的结合位点在α亚基上，但长期以来一直未能完全弄清楚强心苷在α亚基上具体结合位点。最近随着Na+/K+ATPase的X-ray晶体结构的阐释，对这个问题有了比较清楚的了解。例如，已经发现在Na+/K+ATPase的胞外部分有强心苷特异性结合的口袋，而在跨膜螺旋TM1和TM2上的Gln111和Asn122是强心苷与口袋结合的关键残基，啮齿类动物中此2个位点分别为精氨酸和天冬氨酸，因而对强心苷不敏感[10]。此外，Na+/K+ATPase胞外环上其他残基也影响或参与强心苷与口袋的结合。

2 Na+/K+ATPase作为强心苷抗肿瘤靶点的研究进展

尽管目前抗肿瘤化学药物的研究已取得了长足的进步，但临床常用的抗肿瘤化疗药物均不具备对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。寻找具有选择性抗肿瘤作用的药物一直是抗肿瘤药物研究的重要目标。强心苷类药物可以选择性抑制人类肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，因此是一类极具应用前景的抗肿瘤药物。

强心苷药物对心肌有显著兴奋作用而早已用于临床治疗心力衰竭和心房颤动，至今已有近300年的历史，药理学背景非常清楚。其强心作用机理是强心苷选择性地抑制心肌细胞膜上的Na+/K+ATPase，导致细胞内Na+增加，再通过Na+/Ca2+双向交换机制，使细胞 Ca2+内流增加，从而引起心肌细胞收缩，增强心肌的收缩力。

Stenkvist等[11]报道了洋地黄制剂对乳腺癌具有抑制作用，他们以175名患有乳腺癌的患者为研究对象随访了22年，结果发现使用洋地黄的患者死亡率明显低于未使用洋地黄的患者(6%∶34%)。Haux等[12]对9000多例因心脏疾患使用洋地黄毒苷的患者进行了药物疗效分析，证实血液中洋地黄毒苷的较高浓度与血液和泌尿系统肿瘤较低发生率呈显著相关性。现在强心苷化合物抗肿瘤的研究已得到了很多研究者的重视。目前，研究者在强心苷化合物抗肿瘤的体外活性、动物实验、临床研究、抗肿瘤作用机制、增敏作用、抗肿瘤强心苷化合物的结构改造等方面进行了一系列研究，证实了强心苷化合物具有较强的体内外抗肿瘤效果[6]。

但强心苷药物治疗窗口很窄，其血浆浓度过高易引起心率失常，甚至导致个体死亡，而且人体对强心苷的耐受差异较大。而目前的研究显示，强心苷类药物抑制肿瘤生长需要的药物浓度高于其治疗心脏疾病的浓度。因此目前临床常用的强心苷类药物如地高辛、洋地黄毒苷不能直接应用于肿瘤的治疗。强心苷类化合物应用于抗肿瘤要解决的关键问题是解决抗肿瘤与心脏毒性之间的矛盾。一种以非洲大牛角瓜(Calotropisprocera)提取物为原料通过半合成改造的强心苷UNBS1450在比利时和荷兰已进入Ⅰ期临床试验[13]，其裸鼠移植瘤实验表明它对人非小细胞肺癌具有显著的疗效，治疗效果优于替莫唑胺、紫杉醇、伊立替康及米托蒽醌，其心脏毒性仅是地高辛的1/10，而其抑制肿瘤细胞增殖的能力是地高辛的20～100倍。表明强心苷抗肿瘤活性与其强心活性并不是偶联的，通过结构改造可以合成高效低毒的理想的抗肿瘤强心苷化合物。

这类化合物对肿瘤细胞引起的应答是抑制增殖和诱导凋亡，而对心肌细胞则是引起收缩，说明其细胞膜受体Na+/K+ATPase亚基亚型可能不同。从Na+/K+ATPase亚基亚型的多样性可以很容易理解这一点，事实上很多研究发现不同组织来源的肿瘤细胞对强心苷的敏感性也不同，其原因尚不明确，可能是不同组织来源的细胞其Na+/K+ATPase亚基的亚型也不相同。可以认为，强心苷类药物抗肿瘤研究的发展方向在于两方面，一是通过构效关系的研究，人工合成、改造或筛选新的特异性抗肿瘤强心苷化合物，以达到高效低毒的抗肿瘤效果；另一方向是通过对各种组织来源肿瘤细胞Na+/K+ATPase亚基亚型组成的分析研究，寻找强心苷化合物抗肿瘤的适应症。这两方面的研究都需要先明确强心苷化合物抗肿瘤的作用靶点。因此寻找强心苷类药物抗肿瘤作用的特异性靶点，是强心苷抗肿瘤研究最重要的工作之一，可以为特异性抗肿瘤强心苷化合物的设计、筛选和强心苷抗肿瘤适应症的确定提供基础。

强心苷抗肿瘤靶点的研究，目前主要集中在α1和α3亚基上。Majatovic等[14]和Lefranc等[15]认为，α1亚基可能是强心苷化合物抗肿瘤作用的靶点。他们发现，强心苷化合物UNBS1450对过表达α1的人非小细胞肺癌细胞、恶性胶质瘤细胞有很强的抑制作用，采用siRNA干扰α1的表达可以增强UNBS1450的抑瘤效果。Xu等[8]的研究显示，恶变的肝组织和肝癌细胞株的α1表达高于正常肝组织，哇巴因可抑制高表达α1的肝癌HepG2细胞增殖，采用siRNA干扰α1的表达可以增强其抑制效果。但有研究显示，哇巴因对α1表达量低的人乳腺癌细胞株 (BT20)和前列腺癌细胞株 (DU145)肿瘤细胞有抑制增殖的效果，而对α1表达量高的猪肾近曲小管上皮细胞反而有促进增殖的效果[16]。也有研究认为α3亚基可能是强心甾化合物抗肿瘤作用靶点。Newman等[5]的研究发现，夹竹桃苷对高表达α3的肿瘤细胞抑制作用更强，而对只表达α1的肿瘤细胞无抑制作用，对同时表达α1和α3的肿瘤细胞来说，α3∶α1比例高者对夹竹桃苷的抑增殖作用敏感，而α3∶α1比例低者细胞生长不容易被抑制。Li等[17]发现，α3基因沉默可使肝癌细胞对布法林的敏感性下降，认为α3可能是布法林抑制肝癌细胞增殖的作用靶点。可以看出，随着对强心苷抗肿瘤作用了解的深入，我们面对的问题似乎也变得越来越复杂，进一步阐明Na+/K+ATPase亚基的结构、功能以及表达调控，弄清楚强心苷化合物与不同亚型Na+/K+ATPase亚基结合后的相互作用的机制、激活的信号转导途径及引起的细胞反应，以及不同组织来源肿瘤细胞、肿瘤细胞与正常细胞，特别是与心肌细胞膜Na+/K+ATPase亚基亚型构成的区别，是强心苷类化合物发展为临床抗肿瘤药物需要解决的重要问题。相信随着相关研究的深入，强心苷作为具有选择性抗肿瘤效果的药物应用于临床是可以期待的。