病毒样颗粒及其原核表达制备的研究进展

于天飞 张喜文 谢鹏宇 黎 明 樊兴冬 闫 冰

(1齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 161006； 2齐齐哈尔大学计算机与控制工程学院 161006；3黑龙江省兽医科学研究所 齐齐哈尔 161006)

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒的结构蛋白在体外或体内自组装而形成的空心颗粒，不含有病毒的遗传物质[1]。VLPs被认为是非常有效的疫苗载体，很多抗原可以通过基因工程或化学耦连的方法在VLPs表面展示[2]。与传统疫苗相比，VLPs具有良好的免疫原性和极高的安全性，是一种理想的疫苗形式[3]。此外，VLPs还可作为载体蛋白携带外源抗原，是疫苗设计的重要平台[4]。目前，已发现近40种病毒的蛋白能形成VLPs。其中，已上市的3种乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、2种人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)和1种戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)等人类病毒基因工程疫苗均采用VLPs疫苗形式[5]。其他一些针对人或动物疾病的VLPs疫苗也已经处于临床实验阶段[6]。VLPs在科学研究以及商业开发，特别是基因治疗等方面具有极大的应用优势。

1 VLPs的结构

VLPs由1种或几种结构(衣壳)蛋白构成，通过自我组装形成。不同病毒的VLPs的结构不尽相同：有的由1种或2种结构蛋白组成，称为简单VLPs(如细小病毒、乳头瘤病毒、圆环病毒、戊型肝炎病毒和多瘤病毒等)；有的是由数个独立mRNAs编码的结构单位构成的复杂结构(如微小RNA病毒等)；还有的具有来自宿主细胞的磷脂双分子层的脂质囊膜，其上还可能镶嵌有糖蛋白形成的纤突蛋白(如流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等)[7～9]。

2 VLPs诱导免疫应答

VLPs易于被免疫系统识别，能激发机体产生保护性免疫应答，其诱导机体产生免疫应答的方式包括：通过表达在其表面的多价结构结合Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)和模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)激发固有免疫应答反应；诱导强烈的体液免疫应答并产生高水平的IgM；通过主要组织相容性复合体I(MHC I)和主要组织相容性复合体II(MHC II)的交叉呈递途径增强抗原呈递细胞的摄取、加工和呈递抗原的能力。同时，VLPs的体积较小(平均直径约40 nm)，使其容易通过淋巴管进入淋巴结中。在淋巴结，VLPs可以被定居于淋巴结中的树突状细胞摄取，而VLPs本身较小的尺度和高度有序的表位结构易于树突状细胞的吞噬和抗原加工处理，从而有效地诱导机体产生对病毒的免疫保护反应[10～12]。

3 VLPs的制备方法

通常利用重组蛋白表达系统表达结构蛋白后进行体外或体内组装的方法来制备VLPs。制备VLPs的蛋白表达系统可分为真核表达系统和原核表达系统。据统计，在已报道的VLPs中，利用真核表达系统制备的为72%(杆状病毒/昆虫细胞表达系统28%，酵母表达系统20%，哺乳动物细胞表达系统15%，植物表达系统9%)，利用原核表达系统制备的为28%[13]。

真核表达系统具有蛋白辅助折叠与后期修饰等功能，大部分病毒的衣壳蛋白在真核系统都能自组装形成VLPs。但是由于真核表达系统常面临培养周期长、成本高、表达量低和难纯化等难题，制约了VLPs疫苗的研发和应用。制备VLPs的原核表达系统主要为大肠杆菌表达系统。与真核表达系统相比，原核表达系统更早、更广泛地被应用于生物医药领域，并且是公认的高效、低成本、安全性良好的蛋白表达系统。原核表达系统一般用来制备无囊膜的VLPs[14]。

4 VLPs的原核表达制备

大肠杆菌来源的VLPs产量高、成本低，尤其适合开发面向全世界，特别是面向大多数发展中国家的新型疫苗。但是由于颗粒性抗原结构和组装都较为复杂，因此在大肠杆菌中的VLPs组装效率较低。同时，原核表达系统缺少像真核表达系统那样的重组蛋白表达后的修饰能力，不能产生正确的二硫键，表达的重组蛋白的可溶性较差，在表达重组蛋白的过程中会产生脂多糖或内毒素成分。因此，如何利用大肠杆菌进行颗粒性抗原的表达和组装是当今疫苗界的难题之一[14]。近几年来，在利用大肠杆菌表达系统制备VLPs的技术取得了一系列突破。

病毒衣壳蛋白可以通过原核表达系统表达成包涵体，包涵体在变性条件下纯化，然后复性再折叠，再进过自我组装等过程而有效制备，例如人细小病毒(human parvovirus)B19和植物病毒豇豆褪绿斑点病(CCMV)及黄瓜花叶病毒(CMV)的VLPs的制备。另外，也可以同时表达多个结构蛋白，进行多层颗粒共组装，例如传染性法氏囊病毒的VLPs的制备，该病毒的VLPs由VP2、VP3和VP4三种多聚蛋白构成，可以加以表达和组装[15]。

简单的培养条件的改变，如通过低温培养增强重组蛋白可溶性，即可解决正确构象VLPs的自组装等难题，如浓核病毒IHHNV和马铃薯Y病毒(PVY)的制备[16]。另有一些因素，包括表达质粒上的标签蛋白和培养基中的一些成分，也可以影响VLPs的组装。可通过应用不同的融合蛋白表达系统来增加重组蛋白的表达水平和可溶性，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白[17]。

也有其他的原核表达宿主被用来制备VLPs，如lactobacillus乳酸菌。有报道称在在干酪乳杆菌(乳糖诱导表达菌株)体内可通过自我折叠形成人乳头状瘤病毒L1株的VLPs。此外，由干酪乳杆菌制备的L1 VLPs 可以用来作为新型的黏膜免疫活疫苗[18]。荧光假单胞杆菌表达系统具有操作简单、可高效表达可溶性蛋白及培养基谱广泛等优点，可以作为大肠杆菌的替代表达系统来制备VLPs。植物病毒雀麦花叶病毒(BMV)和CCMV的衣壳蛋白已经通过荧光假单胞杆菌表达系统在菌体内可溶性表达，所获VLPs与天然病毒颗粒相似[19]。

5 展望

VLPs作为传染病和非传染病疫苗的候选具有极大的优势。VLPs在没有传统免疫佐剂的存在下自身即可激发有效的免疫应答。VLPs具有和宿主细胞天然的亲和能力，具有细胞靶向作用的潜能。基于VLPs的这些优势，有必要对VLPs进行深入的研究。迄今，虽然已经有数十种的VLPs在实验室中成功制备，但只有极少数能够在疫苗应用中取得突破，获得合适的放大制备工艺、组装工艺和制剂工艺组合是阻碍其发展的重要原因。大肠杆菌表达系统在基因工程药物中已经得到了广泛的应用，但在利用其制备和组装大尺度的、结构复杂的VLPs方面仍然存在诸多问题。从蛋白质结构优化和分子设计入手，同时进行与大肠杆菌的外源表达调控机制相关的功能基因改造，使其更适合VLPs的表达和组装，可能是解决问题的途径。