基于适配体的食源性致病菌检测方法研究进展

刘兆臣，邴欣，王琦（.山东师范大学生命科学学院，山东济南25004；2.山东省产品质量检验研究院，山东济南25002）

基于适配体的食源性致病菌检测方法研究进展

刘兆臣1，邴欣2，*，王琦1
（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省产品质量检验研究院，山东济南250012）

食源性致病菌是危害食品安全的重要因素，对人类健康造成了巨大的危害，越来越受到世界范围的广泛关注，因此建立简单高效的检测方法是食品卫生安全检测中的重要组成部分。适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列，通过指数富集配体的系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从构建的随机文库中筛选得到。适配体对靶物质具有高度亲和力与选择性，多种用于食品中致病菌检测的适配体已被成功筛选和应用。介绍了基于适配体的食源性致病菌检测方法，讨论了适配体的发展及应用前景。

食源性致病菌；适配体；检测

1　食源性致病菌的危害

食源性致病菌是指随食物侵入机体可引发人畜共患病的一类病原微生物，目前我国食源性疾病监测网重点监测的食源性致病菌有水副产品中的副溶血性弧菌、禽畜制品中的沙门氏菌、乳制品中的金黄色葡萄球菌、剩菜剩饭中的蜡样芽胞杆菌、罐头制品中的肉毒梭状芽孢杆菌、凉菜中的李斯特菌以及肠出血性大肠杆菌等，其中有些致病菌还可以产生细菌毒素，一般的灭菌办法很难将其清除，一旦监管不严格，将会严重威胁人类的生命健康。近20年来，向卫生部上报的食品中毒人数逐年递增，其中大部分由食源性致病菌引起［1］。据世界卫生组织统计，70%的食源性疾病由致病性微生物引起［2］。据中国疾病预防和控制中心统计，我国每年的食源性疾病病例中，45%～55%是由微生物因素造成的［3］。根据相关数据显示，在全球范围内，每年有高达15亿的儿童深受食源性腹泻的困扰，其中约300万人因此死亡，并且由食源性致病菌引发的饮用水和食品污染造成的病例占70%［4］。食源性致病菌一方面给国家经济造成了巨大的损失，另一方面也极大地威胁了人们的身体健康和生命安全，已成为目前最为关注的公共卫生问题之一。

2　食源性致病菌的传统检测方法

目前常用的致病菌的检测方法主要有经典微生物检验法（微生物培养法）、微量仪器分析法、分子生物学技术和免疫学检测法等。

2.1经典微生物检验技术

微生物检测方法主要对微生物进行选择性培养与生化分析，微生物经过在营养培养基中増菌培养、选择性培养基分离培养、形态学观察、生化鉴定和血清分型一系列步骤［5］，根据其不同的生理生化特征来对样品中细菌进行定性、定量测定。传统微生物检测技术具有检测符合率及结果稳定率较高的优点，因而被评为是食源性致病菌检测的经典方法。但这种传统方法的检测周期长（一般需要一周），工作量大，并且该方法特异性不强，灵敏度偏低，较易发生错检和漏检，较难实现食源性致病菌现场的快速检测［6］。

2.2仪器分析方法

气相色谱法（Gas chromatography，GC）、毛细管电泳技术（Capillary electrophoresis，CE）、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）和质谱技术（Mass spectrometry，MS）等［7］是当前进行微生物分析的主要仪器分析法，根据不同病原体的形态特征及表面物质的特性或产生的代谢产物的差异经仪器分析后可以呈现不同的图谱特征。利用色谱分析样液中的各种物质成分，从而明确病原菌的特征性标志成分，协助病原菌的诊断检测。微量仪器分析法操作简单快速、精确度灵敏度高，但使用的仪器设备较为庞大且价格较昂贵，不适合应用于食源性致病菌现场的快速检测［8］。

2.3分子生物学技术

实时荧光PCR技术（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）、多重 PCR检测技术（Multiplex PCR）、基因芯片技术（Gene chip technology）、DNA指纹图谱技术是当前应用较为广泛的分子生物学技术，这些新型方法成功应用于实际样品的检测，可以实现快速灵敏地检测食源性致病菌［9］。但在检测中易出现假阳性。

2.4免疫学检验技术

免疫学方法属于超微量分析方法，根据致病菌产生的特异性分泌物和代谢物进行抗原-抗体反应，须结合免疫放大技术放大抗原抗体的特异性结合反应。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫荧光技术（Immunofluorescence technology，IFT）、免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，GICT）、免疫磁珠分离技术是当前免疫学检验技术的研究热点方向。此类方法虽然操作简单、特异性强、样品处理量大［10］，但抗体制备难度大、周期长、成本高。

在食源性致病菌检测领域，适配体可以弥补以上传统检测方法的不足。与以上检测方法相比，适配体的筛选周期短，成本低，可以特异性识别靶物质。因此基于适配体的食源性致病菌检测方法不断发展并逐渐完善。

3　适配体的起源、特点及其在食源性致病菌检测中的应用

3.1适配体的起源

1990年，Tuerk和Gold［11］创建了指数富集配体的系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），并使用该技术筛选获得特异性结合噬菌体T4DNA聚合酶的核酸分子。同年，Nature报道了Ellington［12］等应用SELEX技术筛选6种有机小分子染料的核酸分子，并命名这种核酸分子为“Aptamer”，即适配体。3.2适配体的特点

1）高特异性和高亲和力：适配体与靶物质结合的原理是空间构象的契合，可以在氢键、序列中碱基的堆积作用、范德华力等作用力下与相应的靶分子形成稳定的复合物［13］，而且适配体能够识别靶物质与其类似物结构上的细微差别。

2）靶分子范围广：由于随机区域核苷酸排布是随机的，所以文库容量在1×1013～1×1015［14］，理论上SELEX技术几乎可以获得任何一个与靶分子特异性结合的适配体。迄今为止，已经筛选出了200多种靶物质的适配体，适用范围非常广［8］。

3）筛选周期短：适配体的筛选是一个体外完成的过程，经过8轮～15轮的循环筛选后可获得高亲和力的序列，筛选过程约1个月～2个月时间，然而利用动物试验制备抗体历时长达6个月甚至更久。

3.3适配体在食源性致病菌检测中的应用

应用SELEX技术筛选得到的适配体可直接应用于食源性致病菌检测，也可与磁珠、抗体等物质结合后应用于食源性致病菌检测。

3.3.1基于游离适配体的食源性致病菌检测方法

适配体对目标菌有高度的特异性和亲和力，筛选得到后可直接应用于食源性致病菌检测。李华等［15］通过SELEX技术成功筛选到特异性识别产肠毒素大肠杆菌K88菌体的适配体，可对该菌定性及定量检测，并首次建立了荧光基团标记适配体快速鉴定产肠毒素大肠杆菌K88的检测方法。Cao X等［16］筛选得到对于金黄色葡萄球菌具有高特异性及高亲和力的5条适配体。这5条适配体可识别不同的分子位点，试验结果显示与单独使用一种适配体相比，将5条适配体同时加入到样品中检测金黄色葡萄球菌效果更好。杨小娇等［17］以沙门氏菌O8为靶分子筛选得到9条特异性适配体并荧光标记亲和力最高的B10适配体用于检测沙门氏菌O8，灵敏度可达102cfu/mL。

3.3.2基于适配体-磁珠结合的食源性致病菌检测方法

氨基化磁珠与适配体结合后可以分离富集适配体，基于适配体的亲和力与特异性，可提高反应的灵敏度。韩晓晓等［18］基于SELEX技术，以阪崎肠杆菌ATCC 12868与DSM 18703为靶标筛选得到特异性适配体。基于适配体的特异性，将生物素化的适配体与亲和素化磁珠连接构建了阪崎肠杆菌的新型检测方法。在最佳试验条件下，阪崎肠杆菌ATCC 12868与DSM 18703的检出限均为50 cfu/mL，婴幼儿配方奶粉中加标回收率分别为93.55%～106.67%和94.74%～103.55%。王鑫等［19］筛选得到化脓链球菌和无乳链球菌适配体，以适配体-磁珠为捕获探针，荧光素标记的适配体为显色探针，可以快速高效的检测以上两种致病菌。在优化试验条件下，化脓链球菌和无乳链球菌的检出限分别为70 cfu/mL和50 cfu/mL，牛奶样品中的加标回收率分别为83.9%～103.3%和95.2%～102.5%。Raghavendra Joshi等［20］利用适配体-磁珠为捕获探针在鸡肉残骸清洗液样品中检测沙门氏菌，检测限为102cfu/ 25 mL～103cfu/25 mL样品。

3.3.3基于适配体-抗体结合的食源性致病菌检测方法

因抗体能特异性识别抗原，常会被应用与适配体结合作为捕获探针识别靶细菌。S.H.Ohk等［21］将抗体与适配体连接后修饰光导纤维，应用此传感器检测李斯特菌。在纯培养或混合培养条件下，当该菌的浓度为103cfu/mL时此传感器可将其有效检出。

3.3.4基于适配体-96孔板结合的食源性致病菌检测方法

96孔板作为一种吸附材料常会被用于固定适配体形成夹心法。Nuo Duan等［22］将生物素化的单核细胞增生性李斯特菌适配体固定于96孔板，并分别连接目标菌和荧光标记的适配体，通过荧光值定量检测目标菌。该方法的检测限为75 cfu/mL。徐宝霞等［23］将筛选得到的李斯特菌适配体用亲和素标记，与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素吸附到96孔板作为捕获探针，分别加入待检样品与另一条亲和素标记的适配体以及酶作用底物。显色反应之后通过吸光度值检测李斯特菌数目。该方法的检测限为104cfu/mL。

3.3.5基于适配体-石墨烯结合的食源性致病菌检测方法

石墨烯机械强度大，室温下导电能力低，广泛应用于生物传感器当中。段颖芬等［24］应用SELEX技术筛选得到鼠伤寒沙门氏菌适配体。将荧光标记的适配体吸附于氧化石墨烯表面，加入目标菌后，利用荧光猝灭构建荧光适配体传感器。该方法的检测限为102cfu/mL，并在103cfu/mL～108cfu/mL浓度之间呈线性关系，同时有很高的选择性。贾飞等［25］将氧化还原石墨烯修饰到玻碳电极表面，并连接巯基化适配体作为捕获探针。沙门氏菌被适配体捕获并固定在电极表面，从而引起电流变化。该电流型适配体通过电信号变化对沙门氏菌进行定量检测。检测限为80 cfu/mL，检测时间仅为1 h。

3.3.6基于适配体-纳米金结合的食源性致病菌检测方法

在溶液中适配体可与纳米金结合，当靶物质存在时，适配体从纳米金表面脱落与靶物质特异性结合，纳米金粒子的颜色和形态发生变化。基于颜色变化，可对靶物质定性及定量检测。Jun Hui Soh等［26］将赭曲霉素适配体与纳米金粒子孵育，加入目标菌后测定溶液吸光值可以对目标菌定量。当目标菌浓度为1 nmol时，该方法可将其有效检出。Bin Wang等［27］将黄曲霉素适配体修饰到纳米金粒子上，通过静电相互作用修饰荧光碳、氮量子点。在目标菌存在的条件下，发生荧光猝灭。该方法的线性范围为5 pg/mL～2.00 ng/mL，检测限为5 pg/mL。

4　总结与展望

综上所述，适配体方法在食源性致病菌检测领域得到了初步应用，展现了广泛的发展应用前景。然而就适配体而言，还有部分问题需要解决，包括如何创建更有效的筛选平台，提高筛选效率，研究适配体与结合复合物的亲和作用机制等。相信随着适配体技术研究的发展，以适配体为基础的食源性致病菌的高效快速检测方法会不断建立，并在其他领域有着更深入的应用。

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Research Progress of Detection Method of Food-borne Pathogenic Bacteria Based on Aptamers

LIU Zhao-chen1，BING Xin2，*，WANG Qi1
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Jinan 250012，Shandong，China）

Food-borne pathogenic bacteria is the main factors that endanger food safety and it has done great harm to human health，which has received more and more widespread attention.So establishing simple and efficient detection methods is an important part of food hygiene and security detection.Aptamers are single-stranded oligonucleotides that bind to target molecules with high affinity and specificity，which are selected by SELEX from a synthetic random ssDNA pool.A variety of aptamers for the detection of food-borne pathogenic bacteria have been successfully screened out and applied.This paper will introduce detection methods of food-borne pathogenic bacteria baesd on aptamers and discuss its application process and development prospect.

food-borne pathogenic bacteria；aptamer；detection

2016-05-12

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2014QK122）

刘兆臣（1990—），男（汉），硕士，研究方向：产品质量安全。

邴欣（1977—），男（汉），高级工程师，博士，研究方向：产品质量安全。