乳酸菌与乳糖酶

何熹，王彦宁，李超，王艳萍（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

乳酸菌与乳糖酶

何熹，王彦宁，李超，王艳萍*
（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

介绍了β-半乳糖苷酶的来源分布、基因组成差异、工业中的用途以及生产制备方法；并以乳酸菌为例，阐述了不同来源乳酸菌中乳糖酶的种类，乳酸菌中乳糖酶基因的克隆，相关的表达体系，以及利用乳酸菌生产β-半乳糖苷酶的方法以及发展前景。

β-半乳糖苷酶；乳酸菌；基因克隆

1　乳糖酶研究

1.1乳糖酶的分布

乳糖酶主要存在于年幼动物肠道、植物以及真菌、酵母和细菌等微生物中。目前已经从多种微生物中发现乳糖酶，比如：细菌中有乳酸菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等；霉菌有米曲霉、黑曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸酵母等；放线菌有天蓝色链球菌等［2］。

1.2乳糖酶基因

乳糖酶的编码基因为β-半乳糖苷酶基因，对该基因的研究非常早，1961年，法国的雅各布（Jacob）和莫诺德（Monod）通过对大肠杆菌β-半乳糖苷酶的研究，提出了乳糖操纵子学说。1969年，哈佛大学Beekwith博士研究小组应用DNA分子杂交技术首次分离得到大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因［3］。此后，许多其他不同生物的β-半乳糖苷酶基因先后被发现并克隆。

通过对来自不同生物的乳糖酶基因进行比对，发现来自同一属种的生物，其乳糖酶基因相似性较高，以保加利亚乳酸菌为例，Zhang（2012）［4］对不同菌株的Lb.bulgaricusstrainwch9901和Lb.bulgaricusstrainstrain 1.1480进行测序分析，并且通过GenBank比较分析，二者的相似度达到99.3%以上。与之相对，不同属种中存在的乳糖酶，其基因差异性就很大，张伟（2002）［5］将来源于一株亮白曲霉（Aspergillus candidus）的乳糖酶基因与酵母等乳糖酶基因比较，发现该基因与来源于酵母、拟南芥以及人的乳糖酶基因同源性均较低，与人的相似度只有3.1%，最低如海栖热袍菌（Thermotoga maritima）仅为1.9%。

国际生物化学与分子生物学联盟（IUBMA），根据氨基酸序列相似度，将已发现的各种糖基水解酶（比如葡萄糖基水解酶，木聚糖酶等）分成了不同家族，以GH+数字命名（http：//www.cazy.org/Glycoside-Hydro－lases.html），截止到2015年8月，一共发现133个家族。其中乳糖酶位于GH1，GH2，GH35以及GH42家族：GH1类的乳糖酶主要具有6-磷酸-β-半乳糖苷酶活性，作用底物是某些含有磷酸基团的糖类；GH35家族中的乳糖酶绝大多数来源于动植物等真核生物；而GH2，GH42家族中的乳糖酶许多都是来自大肠杆菌、乳酸菌等原核生物。

1.3乳糖酶的用途

综上所述，实施任务打包定价方案，价格方面会产生很大的影响，单个任务的价格会适当地降低，减少了商家的投资费用，有利于众包投放市场[12]．同时，将任务打包发布，商家为会员设计了最优的工作路径，虽然单个任务的定价降低了，但会员的工作效率却有了相应的提高．此方案的实施有利于任务完成度的提高，保证所有的任务都有人去做，所有的人都有任务做．

乳糖酶在工业上主要用于乳品工业，利用其水解作用水解牛乳等乳制品中的乳糖，生产低乳糖乳制品供乳糖不耐受人群食用。此外，利用乳糖酶的半乳糖苷的转移作用生产的低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）已经开始投放市场，GOS不为人体吸收，但能被肠道内双歧杆菌所利用，是很好的益生元［6］。

1.4乳糖酶的生产

乳糖酶的工业生产方法主要是微生物发酵法。目前已经投放市场的乳糖酶产品，一种是克鲁维酵母制备的乳糖酶，另一种是曲霉制备的真菌乳糖酶。克鲁维酵母菌的乳糖酶的分子量是201 kD，是由3 078核苷酸编码的1 025个氨基酸组成的复合蛋白，该酶最适pH值为6.0～7.0，最适温度40℃～45℃，而且产酶方式是胞外分泌表达。来源于黑曲霉乳糖酶的分子量较小，一般为100 kD～130 kD，最适pH3.5～4.0，最适温度50℃～60℃，黑曲霉的乳糖酶也能胞外分泌表达［7］。目前除了克鲁维酵母和曲霉外，其他来源的乳糖酶也在研究当中，近年来就有不少乳酸菌乳糖酶研究的报道。

2　乳酸菌研究

2.1乳酸菌简介

乳酸菌是一类利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌是广义范畴的概念，是非规范的细菌分类学名称［8］。乳酸菌广泛地存在于自然界、动植物体、乳制品和发酵食品中，且大多数为非致病菌，由于具有许多有益的代谢特征和人类长期安全使用等特点，被广泛认为是GRAS（GenerallyRecognizedAsSafe）级的微生物。

乳酸菌细胞常呈球状和杆状。乳酸杆菌族中食品工业经常使用的发酵菌种诸如德氏乳杆菌（Lactobacillus delbreckii）、植物乳酸杆菌（Lactobaillus plantarum）等，而保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus）是制作酸奶以及乳酸饮料的重要菌种。链球菌族中的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是制作发酵乳制品的重要菌种之一。

2.2乳酸菌中的乳糖酶

来源于乳制品中的乳酸菌，由于其生活环境的需要，其碳源来源主要是乳制品中的乳糖，需要利用自身的乳糖酶将乳糖降解利用，而且鉴于这些乳酸菌具有无毒安全的特性，有些乳酸菌还具有改善肠道菌群，增强人体免疫力，抗肿瘤，降低血液胆固醇，降血压等保健功能［9］，如果将其作为提取乳糖酶的材料，则具有得天独厚的优势，这就是近些年来对乳酸菌乳糖酶研究较多的原因之一。而已经发现的来自乳酸菌的乳糖酶基因，都来自于GH2，GH42家族。

2.2.1GH2家族

目前所有在乳酸菌种发现的β-半乳糖苷酶基因，绝大部分都属于GH2家族（Clarissa Schwab 2010）［10］，而该家族的基因又分2大类：lacZ和lacLM。

含有lacZ基因的乳酸菌主要有St.thermophilus，Lb.delbrueckii subsp［11］，LB.bulgaricu［12］以及部分双歧杆菌。LacZ蛋白是由1～4个亚基组成的同源多聚体［13］，从不同物种提取的半乳糖苷酶的蛋白质序列有着较高的同源性和相似性，分子量在100 kD～850 kD之间，其中大肠杆菌的半乳糖苷酶分子量最大，为520 kD～850 kD。

含有lacLM基因的乳酸菌比较多，包括Leuconostoc lactis，Lb.sakei［14］，Lb.coryniformis［15］，Lb.acidophilus［16］，Lb.plantarum［17］，Lb.helveticus以及Lb.reuteri［18］。该蛋白的特点是含有2个亚基：lacL编码的大亚基蛋白分子量为73 kD～75 kD，由长1 800 bp～1 900 bp核酸编码；lacM编码小亚基蛋白分子量为35 kD，由长900 bp～1 000 bp核酸编码。

2.2.2GH42家族

在Lactobacillus crispatus、Lactobacillus acidophilus以及Lactobacillus sp中还发现另一种β-半乳糖苷酶基因，该基因编码的乳糖酶只有一个亚基，编码的氨基酸序列与GH2家族差异明显。此外本实验室分离的一株马乳酒样乳酸杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）也发现了这种类型的乳糖酶基因的存在。

3　乳糖酶的异源表达

为了获得高产酶量高的菌株，除了常规的微生物诱导筛选方法外，目前常采取将乳糖酶基因克隆后转化到其他细胞中过量表达的方法，常见的表达载体有以下几种。

3.1大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是研究最为透彻的系统，由于其具有遗传机理研究清晰、易于培养操控、发酵周期短和工艺简单等诸多优点，已经成功的实现了多种蛋白的原核表达。许多外源的乳糖酶已在大肠杆菌中得到了高量的表达：章莎莎（2011）［19］通过从乳杆菌（Lactobacillus sp.B164）中克隆得到一个乳糖酶基因bg42-164，将其连接pET-30a载体并转入大肠杆菌，成功表达出了乳糖酶的活性，该酶最适反应温度为50℃，最适pH6.0，经50℃处理30min后，剩余酶活力保留80%以上，该酶具有较好的高温活性和热稳定性。王政（2010）［20］从保加利亚德氏乳酸中扩增出3 048 bp的乳糖酶基因并将其克隆至载体pGEX-6p-1，同样在大肠杆菌中成功表达出乳糖酶活性，经诱导后蛋白的表达量最高能达到菌体蛋白总量的41.9%。

3.2酵母表达系统

酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足［21］。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。常见的酵母表达系统主要有酿酒酵母和毕赤酵母表达系统。与酿酒酵母相比，毕赤酵母质粒稳定高，拷贝数稳定，表达的重组蛋白产量大，活性高，而且重组基因稳定，不易丢失［22］。张伟、范云六等［23］将克隆的亮白曲霉、（Aspergillus candidus）乳糖酶基因插入到毕赤酵母中，毕赤酵母表达系统可高效地表达有生物活性的乳糖酶，分泌表达量近6 g/L，酶活为3 600 U/mL。不过对于来源于乳酸菌这类原核生物乳糖酶基因的表达，成功的例子并不多，这可能是因为在酵母这种真核表达系统中，缺乏转运原核微生物中某些氨基酸的tRNA，从而导致蛋白质无法正常翻译。

3.3乳酸菌表达系统

以乳酸菌为载体的高效表达系统的构建和应用成为近年来的研究重点，主要是因为与大肠杆菌表达系统和酵母表达系统相比，乳酸菌表达系统在安全性方面具有明显的优势：首先乳酸菌本身即为安全级益生菌，作为一种原核表达系统，易构建成食品级的基因克隆及表达系统，可以有效提高基因工程产品的安全性［24］；其次在乳酸菌载体中使用的选择标记主要是乳酸菌素Nisin，Nisin是乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp）产生的一种小肽，对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，而且作为一种天然食品防腐剂，已经通过美国FDA的安全认证，对人体无毒［25］。可通过构建含有Nisin抗性基因nisr的质粒，当含有外源片段质粒的乳酸菌在Nisin琼脂培养基中培养时，转化子就能筛选出来，因此是目前常用的安全性选择标记。Clarissa Schwab（2010）将Lb.acidophilus，Lb.plantarum，St.thermophilus等乳酸的乳糖酶基因插入表达载体pAMJ586，并在乳酸乳球菌（Lactococcus lacti）中成功表达［26］。当然，乳酸菌表达系统目前尚未在工业化方面大规模使用，主要是其还有许多需要完善的地方，比如经改造后的无质粒营养缺陷型菌株，在大规模工业生产的复杂环境中难以存活；乳酸菌中大部分质粒功能还不是很透彻，开发乳酸菌质粒载体种类有限；特别是外源基因在乳酸菌中表达之后，由于乳酸菌细胞壁为紧密编织，导致一些分泌蛋白无法分泌而滞留在细胞壁上，影响的产品的提取效率［24］。

4　乳糖酶展望

中国预防医学院营养与食品卫生研究所调查发现，黄色人种，尤其是亚洲人中乳糖不耐症患者较多，我国成年人饮奶后乳糖吸收不良可达80%［27］，因此只有开发添加乳糖酶后的低乳糖的乳制品方能满足他们的需要。乳酸菌种类繁多，大部分安全无毒，而且能在温度、酸碱度差异较大的环境下生存，这就为我们制取能适应不同生产加工条件的乳糖酶提供了丰富的资源库。此外，如果将不同来源的乳酸菌乳糖酶制成复合酶制剂，不仅可用于降解乳制品中的乳糖，还能合成作为肠道益生元的低聚半乳糖GOS，这样大大提高了食品的营养价值。因此通过开发乳酸菌来制取乳糖酶等产品，是具有非常广阔市场前景的。

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Lactobacillus and Lactase

HE Xi，WANG Yan-ning，LI Chao，WANG Yan-ping*
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The source and the distribution，the difference，industrial application and production method of βgalactosidase were introduced.Using lactobacillus as example，the paper also expounds the type of β-galactosidase in different lactobacillus，gene cloning and related expression system from lactobacillus，and the method of β-galactosidase production by lactobacillus as well as the prospects for development.

β-galactosidase；lactic acid bacteria；gene cloning

2015-09-08

“十二五”科技部高科技发展研究计划‘863计划'项目（2011AA100904）；国家自然基金（青年基金）项目（31301678）

何熹（1972—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品科学。