银杏蛋白提取纯化及其功能应用研究进展

张晓娟，胡选萍，赵辉（.陕西理工学院生物学院，陕西汉中7300；.陕西理工学院体育学院，陕西汉中7300）



银杏蛋白提取纯化及其功能应用研究进展

张晓娟1，胡选萍1，赵辉2
（1.陕西理工学院生物学院，陕西汉中723001；2.陕西理工学院体育学院，陕西汉中723001）

摘要：综述了银杏叶及种仁中蛋白的研究概况，从银杏蛋白分离纯化、性质功能及应用等方面进行论述，并对银杏蛋白进一步研究方向、开发应用前景进行了探讨，为银杏蛋白进一步研究及产品开发奠定基础。

关键词：银杏蛋白；提取纯化；应用

银杏（Ginkgo biloba）俗称白果树，起源于中国，为银杏科银杏属多年生落叶乔木，距今已2亿多年，是稀有的裸子植物。银杏是世界上珍贵的药用植物资源，其叶、果均有较高的药用价值。银杏具有很强的抗病原菌侵染能力。因此，自然界中，银杏几乎不染病。我国的银杏资源约占世界70%，银杏产品开发具有相当大的优势。近年来，银杏研究主要集中在银杏叶提取物及其在医药保健方面的作用［1-4］，关于银杏蛋白的研究较少。银杏蛋白主要由两种不同分子量的蛋白组成，一种分子量为50 000，包含一个α酸性亚基和β碱性亚基，二者通过二硫键缔合；另一种蛋白分子量为31 000，同样是由一个α酸性亚基和β碱性亚基通过二硫键缔合而成［5］。银杏叶主要含醇溶性蛋白质，银杏种子以水溶性和盐溶性蛋白质为主，主要有白蛋白、球蛋白，含有少量的醇溶蛋白和碱溶蛋白、谷蛋白［6］。银杏种仁中蛋白质的含量在10%左右（干基含量）。银杏种仁蛋白氨基酸组成合理，属于优质蛋白。

研究发现，银杏叶及种仁中存在抗菌蛋白，对病原菌具有抑制作用，可用于病原菌的生物防治，在减轻病原菌对农作物危害的同时，避免了化学防治对人及环境的危害。因此，其研究意义重大。抗菌蛋白是具有抗菌活性的多肽、蛋白质、不同蛋白的复合物或者蛋白与糖或脂的复合物，分子量多为几百到30 000 Da以上。从植物中纯化的大部分抗菌蛋白一般对某些真菌有较强的抑制作用，而对细菌几乎没有抑制作用［7］。

目前，关于银杏蛋白研究的综述较少，本文论述了银杏蛋白的分离提纯、性质功能、开发利用现状及前景，为进一步研究提供参考。

1　银杏种仁蛋白的提取纯化

1.1提取

近年来，国内外对银杏蛋白的研究主要集中在提取和功能性质上，制备蛋白的方法有水提法、酶法（糖酶、蛋白酶、植酸酶和复合酶法等）、碱提酸沉法、物理分离法以及有机溶剂法制备等，水提法提取率低［8］。酶法提取成本较高，物理分离法对设备要求较高，有机溶剂提取易造成有机溶剂残留且生产成分较高。相比之下，碱法提取工艺简单、成本低，制备得到的蛋白具有良好的起泡性、吸油性和持水性等特性，可用于食品加工，因而在蛋白制备中普遍使用。碱提酸沉法提取银杏种仁蛋白流程为：银杏种仁冷冻干燥，粉碎—脱脂—4℃，NaOH溶液提取—离心—上清调pH至4.62—沉淀即为银杏种仁蛋白。

为进一步提高银杏蛋白提取率，许多研究对银杏蛋白的提取工艺进行优化。贾韶千等［9］应用均匀设计法对碱法提取银杏种仁蛋白工艺进行了优化。在提取时间12 h、料液比1∶26 g/mL、NaOH浓度0.2%条件下，蛋白的提取量为99.99mg/g，提取率达到了89.14%。

黄小炯等［10］采用磷酸缓冲液浸提，硫酸铵分级沉淀法得出银杏果仁抗菌粗蛋白适宜提取条件为：银杏果仁与磷酸缓冲液的料液比为1∶4 g/mL，温度4℃，pH为7.0条件下提取6 h。研究通过4种溶剂从银杏果仁抗菌粗蛋白中分离出4种不同溶解性的粗蛋白，其中水溶性蛋白质的抑菌性最强。李盼盼等［11］采用超声辅助法提取银杏蛋白，通过Central-Composite中心组合设计对提取工艺进行优化，得最佳提取条件为提取温度45℃，液料比20∶1 mL/g，pH 10，超声时间20 min，功率300 W，在此试验条件下蛋白溶出量为61.748 g/mL。张风梅等［12］得到银杏盐溶蛋白优化提取工艺，NaCl浓度为0.14 mol/L，pH为8.0，提取温度4℃、时间4 h，浸提次数大于3次。

1.2纯化

牛卫宁等［13］将银杏果仁经硫酸铵沉淀，上清经CM-52离子交换柱层析和SephadexG-50凝胶过滤层析后分离纯化出一个分子量为13 000 Da的抗菌蛋白。刘缙等［14］通过40%及80%（NH4）2SO4分级盐析，CM Sephorose F.F.离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析，从银杏种仁中分离纯化到一种表观分子量约为12 kD的抗菌蛋白，该蛋白对真菌黄瓜镰刀孢菌（Fusariumoxysporum）具有明显的抑制作用。Huang等［15］通过DEAE-Cellulose 52对白果清蛋白进行初步分离纯化得到4个蛋白峰段（G1，G2，G3和G4），G4蛋白溶液经Sephadex G25去盐，PEG2000浓缩，通过DEAESephadex A50进一步对G4蛋白峰进一步纯化，最终从白果清蛋白中纯化出一种新的具有强氧化性的分子量为29，247 Da的蛋白G4b。Yang等［16］将银杏果仁粗蛋白提取液通过40%～80%硫酸铵沉淀预处理，DEAE-cellulose 52柱纯化，再经过Sephadex G-200纯化得一种分子量为32.12 kDa的糖蛋白，为进一步研究该蛋白的性质功能奠定基础。Fan等［17］通过响应面法对银杏粗蛋白的微波冷冻干燥工艺进行了优化，得出最佳工艺为微波功率：408W～421W，材料厚度15mm，预冷温度：-20℃至-21℃。

2　银杏蛋白性质功能及应用

2.1性质功能

国内外对银杏种仁蛋白的性质功能研究发现，银杏种仁蛋白具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗衰老、和免疫调节等作用［18-22］，具有重要的应用价值。

Huang等［15］从银杏叶中鉴定出一种分子量为4 244.0 Da的一种蛋白GAFP，发现它对佐佐木薄膜革菌（P.sasakii Ito），链格孢菌（A.alternata（Fries）Keissler），禾谷镰孢菌（F.graminearum Schw）和串珠镰刀菌（F.moniliforme）有抑制作用，抗菌活性在不同的真菌中存在差异。白果清蛋白能显著增强小鼠的免疫调节能力［21］；具有抑制S180肿瘤生长作用，该作用可能与其抗氧化活性有关［19］；能在一定程度上延缓自然衰老小鼠及半乳糖亚急性致衰老模型小鼠的衰老过程［20］。研究表明银杏蛋白G4b还具有抑制DNA损伤，保护机体DNA的作用，当G4b浓度为500 μg/mL，抑制率达到90.3%［15］。研究表明银杏球蛋白乳化能力、乳化稳定性、黏度均高于银杏清蛋白。Deng等［23］对分离到的白果分离蛋白（GPI）、白果清蛋白（GAP）和白果球蛋白（GGP）的性质功能进行了分析，发现GAP具有很强的吸油能力（9.3 mL/g）、发泡性（67.8%）、乳化性（65.4%）和乳化稳定性（90.6%），GPI的吸水性最高（1.93 mL/g），GGP的泡沫稳定性最高（55.5%）。

2.2应用

白果蛋白及其深加工产品——银杏多肽可作为功能添加剂应用于药品开发及食品领域。银杏抗菌蛋白（肽）可用于动植物转基因工程。通过导入抗菌肽基因，获得抗病植株，从而应用于农业生产；利用基因工程途径生产抗菌肽，可解决从生物体中提取抗菌肽成本高、得率低的问题。

近年来，银杏多肽制备成为一个研究热点。多肽具有多种生物活性，其生物效价和营养价值比游离氨基酸更高，因此，将银杏蛋白进一步酶解加工成银杏多肽是银杏产品深加工的一条有效途径。目前研究较多的银杏多肽是银杏抗氧化肽，后者具有较强的抗氧化活性对脂质过氧化有一定的抑制作用，可作为一种广泛的氧化剂，安全性高，可兼做食品药品。银杏多肽制备主要采用酶法生产，具有安全性极高、价廉、条件易控制等优点［24-26］。酶的选择是生产多肽的关键。单一蛋白酶只能使少量蛋白溶解，采用两种以上的蛋白酶水解效果较好。酶法生产的关键步骤是酶解物中多肽的分离纯化。张焕新等［27］采用Alcalase碱性蛋白酶水解银杏果蛋白，对水解产物进行超滤获得小分子量的银杏肽。贾韶千等［28］采用葡聚糖凝胶sephadexG-25、sephadexG-10和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对银杏种仁蛋白的酶解产物进行分离纯化，得到了纯度较高的抗氧化肽组分C8和C9，通过液相色谱串联四级杆飞行时间质谱测定C8的分子量为452.21 Da，并通过全自动氨基酸分析仪测定其氨基酸组成。

3　前景展望

近些年，植物源产品的开发成为研究热点。我国银杏资源的开发利用起步较晚。目前，市场上有关银杏的深加工产品比较单一，主要以银杏提取物为主，银杏产品深加工迫在眉睫。近年来，病原菌对农作物的危害不断加重，利用银杏抗菌蛋白对病原菌进行防治安全环保，是病害防治的一个趋势，因此，深入研究银杏叶及果仁中的抗菌蛋白，进一步优化其提取纯化工艺意义重大。以银杏蛋白为原料酶法生产银杏抗氧化肽解决了其在银杏植物体内含量较低的问题，发展前景广阔。

此外，研究发现，银杏果仁中含有糖蛋白，糖蛋白参与生物体的细胞识别及信号转导过程，在免疫调节、抗肿瘤、抗炎、降血压、血脂、抗氧化和抗衰中发挥重要作用［29］。目前，有关银杏糖蛋白的研究较少，有研究证实从白果中分离的具有抗氧化和抗衰老作用的多个分子量为29 248 Da的白果清蛋白是一种糖蛋白［16］，银杏糖蛋白的研究将丰富蛋白质的作用及机理，同时为银杏产品的开发开辟了一条新途径。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.046

基金项目：陕西省科技厅项目（2014K14-03-03）

作者简介：张晓娟（1980—），女（汉），讲师，在读博士，从事生物工程专业教学及科研。

收稿日期：2015-04-05

Research Progress on Extraction，Purification，Function and Application of Ginkgo biloba Proteins

ZHANG Xiao-juan1，HU Xuan-ping1，ZHAO Hui2

（1．School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China；2．Department of Physical Education，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）

Abstract：This article summary the research progress of proteins from ginkgo leaf and seed.It contains extraction and purification，character and function，application of the Ginkgo biloba protein.In addition，discussion of research direction，prospective of development and application of Ginkgo biloba protein were also included. This paper provide basis for research and product development of the Ginkgo biloba protein.

Key words：proteins of Ginkgo biloba；extraction and purification；application