生物组织中几种有机化合物的定量检测

王子武 孙海荣

(安徽省利辛高级中学 236700)

在中学生物学教材中，介绍了对有机化合物进行的定性检测。例如，淀粉遇碘呈蓝色；蛋白质与双缩脲试剂反应生成紫色物质等。本文介绍几种常用的有机化合物的定量检测方法。

1 蛋白质含量的测定

1.1 凯氏定氮法 蛋白质中主要含C、H、O、N等元素，与浓硫酸共热后，C、H分别氧化成CO2和H2O，N则转变成氨，氨进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。消化液经强碱碱化之后，游离出氨，利用水蒸气将氨蒸馏到酸液中，根据酸液被中和的程度可计算出样品的含氮量。蛋白质平均含氮量为16%，即1 g氮相当于6.25 g蛋白质，用测定的含氮量乘以6.25，即为样品中的蛋白质含量。由于三聚氰胺含氮量较高，不法商人在奶粉中添加三聚氰胺以提高奶粉的含氮量，利用的就是这个原理。此法易受到其他含氮有机物的干扰，因而测到的结果为粗蛋白。

1.2 双缩脲试剂法 蛋白质中的肽键在碱性条件下，可与双缩脲试剂中的硫酸铜反应生成紫色络合物，即双缩脲反应。一定条件下，其颜色深浅与蛋白质的浓度呈正相关，利用分光光度计测定标准蛋白质溶液和待测样品的吸光度，即可计算出样品中蛋白质的含量。此法可用于测定1～10 mg/mL含量的蛋白质。

1.3 紫外吸收法 由于多数蛋白质含芳香族氨基酸，使蛋白质的紫外吸收峰在280 nm，这一波长下的吸收值与蛋白质浓度呈正相关，利用这一原理可测定蛋白质的含量。该方法不消耗蛋白质样品，盐类干扰不明显，应用广泛，可用于测定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白质。

1.4 考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，前者的可见光吸收峰值为465 nm，后者的吸收峰值为595 nm。在595 nm波长下，结合物的光吸收量与蛋白质含量呈正相关[1]。此法灵敏度高，但样品不能回收，可用于测定0.01～1.0 mg/mL含量的蛋白质。

2 糖类含量的测定

2.1 淀粉含量的测定——DNS法 淀粉在稀硫酸作用下水解为葡萄糖、麦芽糖等还原性糖，还原性糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-一硝基水杨酸。一定范围内，还原糖的含量与棕红色物质的颜色深浅呈正相关，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

2.2 葡萄糖含量的测定——碘量法 I2与NaOH作用可生成次碘酸钠(NaIO)，次碘酸钠可将葡萄糖分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与葡萄糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化成NaI和NaIO3。当酸化时，NaIO3又恢复成I2析出，用Na2S2O3标准溶液滴定I2，从而可计算出葡萄糖含量。

2.3 纤维素含量的测定——比色法 纤维素含量测定的方法很多，例如，酸碱醇醚法、酸性洗涤剂法、碘量法及比色法等。其中酸碱醇醚法是国际法，但过程比较繁琐，以下介绍比色法。纤维素是由葡萄糖基组成的多糖，在酸性条件下加热使其分解成葡萄糖。然后在浓硫酸作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比较测定。

3 脂质含量的测定

3.1 脂肪含量的测定——索氏提取法 脂肪含量的测定有索氏提取法、酸水解法、巴布科克法、益勒式法等，其中具有代表性的是索氏提取法。脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂，可用无水乙醚将游离的脂肪萃取出来，然后回收，除去溶剂并干燥，残渣即为脂肪。此法收集的脂肪中含色素、蜡状物等杂质，故索氏提取法测得的脂肪为粗脂肪。

3.2 胆固醇含量的测定——化学试剂比色法 胆固醇含量测定的方法有化学试剂比色法、酶分析法、荧光法、气相和高效液相色谱法等五类，临床实验室最常用的是化学试剂比色法。胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛作用，生成紫红色物质，此物质在533 nm对光有最大吸收，可用分光光度计测定，通过比较标准胆固醇溶液与待测样品的吸光度，可确定胆固醇的含量。

3.3 磷脂含量的测定——钼蓝比色法 磷脂经灼烧成为五氧化二磷，后者可被热盐酸变成磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠，用硫酸联氨还原成钼蓝，用分光光度计在波长650 nm处测定钼蓝吸收度，与标准曲线比较，可计算磷脂含量。

4 核酸含量的测定

4.1 紫外吸收法 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，最大吸收值在250～270 nm之间，吸收峰在260 nm。在波长260 nm紫外光下,1个OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50 μg/mL，单链DNA或RNA为20 μg/mL，可计算核酸样品的浓度。

4.2 荧光法 核酸本身在常温下有较弱的内源荧光，但荧光量子产率低，不能直接加以测量，可用一些荧光小分子物质作为生物探针，与核酸作用后导致荧光度的增强或减弱来进行测定。常用的探针物质主要有荧光染料、金属离子、金属配合物及纳米粒子等[2]。

5 其他有机化合物含量的测定

5.1 ATP含量的测定——高效液相色谱法 国内外ATP含量的测定方法可归纳为层析法、电泳法和光学分析法三大类，层析法中的高效液相色谱法最为常用[3]。该方法的原理为：利用二次蒸馏水配制一定浓度的ATP标准溶液，然后利用高效液相色谱测试仪，对ATP标准溶液和待测样品在相同的色谱条件下分别单独测定，把得到的标准溶液的色谱峰面积与被测样品的色谱峰面积进行比较，求得被测组分的浓度。

5.2 色素含量的测定——分光光度法 绿叶中的色素不溶于水，而易溶于有机溶剂。同时，色素在植物细胞内是以色素蛋白质复合体的结构存在。通常用80%丙酮或95%的乙醇提取色素。应用分光光度计在某一特定波长下测定吸光度，代入80%丙酮或95%乙醇的色素计算公式，可计算出溶液中色素的含量。