基因编辑技术及其应用研究进展

夏 天 林仙花 胡雪峰

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

基因编辑技术是修饰特定基因的新型分子工具，包括锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)法、转录激活类效应因子(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)法和成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated cas, CRISPR-Cas)法。基因编辑技术可以用来标记任何感兴趣的基因位点，删除或者修饰特定基因序列，分析由基因编辑产生的突变表型则可以探索相关基因元件的功能。本文综述基因编辑技术所涉及的3种酶法及其应用研究进展。

1 ZFNs法基因编辑技术

1.1 锌指蛋白与ZFNs法基因编辑 锌指蛋白是在真核生物中分布最广的一类蛋白质，研究表明，人类基因组可能有近l%的序列编码含锌指结构的蛋白网。锌指蛋白是一系列含手指状结构域的转录因子，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面发挥着重要的作用。近年来已成功设计出特异性锌指蛋白元件，用于调节疾病相关基因的表达，为疾病的基因治疗提供了有用的手段，有着广阔的应用前景。

锌指核酸酶由锌指蛋白( zinc finger protein, ZFP)和限制性内切酶(Fok I)两部分融合而成。其中ZFP的功能是识别特异的DNA序列，而Fok I则行使切割功能域的功能。1983年，Klug等率先在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子IIIA中发现重复锌指结构域，并将其命名为锌指( ZF)基序。ZFP由ZFs串联而成，每个ZF由30个氨基酸残基组成，这些氨基酸构成的两串α螺旋组氨酸配体和两串β折叠半胱氨酸配体，围绕中央锌离子形成一个独立的四面体结构。每个ZF通常可以识别3或4bp DNA序列[1]，锌离子起着稳定Cys2His2 ZF折叠结构的作用。

已经发现，锌指蛋白有3种与DNA靶向联合的结构形式：小鼠体内3指的锌指蛋白268( zinc finger protein 268, Zif268)、果蝇体内2指的锌指轨迹蛋白( tramtrak, TTK)以及人类体内5指的神经肿瘤胶质相关致癌基因家族锌指蛋白(gliomma-associated oncogene family zinc finger, GLI)。Zif268具有一种与结合DNA的简单组块模型：3个锌指凭借α螺旋的氨基呈一定角度嵌入DNA双螺旋大沟( major groove)，以每个起识别作用的氨基酸对应一个碱基的方式与DNA三联体碱基相连。每个ZFs识别碱基时都会受到相邻ZFs的影响。TTK的第一组锌指与Zif268相比多一条β折叠。GLI只以其后端的两指与DNA紧密相连[2]。

1986年，Chandrasegaran开始研究一种可标记特定基因的嵌合型限制酶，其在细胞内可产生特异性核酸内切位点，可望用来实现基因编辑。1996年，Kim报道锌指基序和Fok I核酸酶构成的修饰酶可以在预设位点切割DNA。锌指蛋白作为可拆分的DNA结构域，Fok I限制内切酶作为非特异性切割域，两者结合构成的锌指核酸酶在预定位点切割DNA，其发现和应用是基因组编辑技术的重大突破[3]。

1.2 ZFNs法基因编辑技术的应用 2005年，Sangamo生物公司运用ZFNs第一次成功标记人类细胞内源性基因，即在伴X染色体重度免疫缺陷症患者体内标记突变的IL-2Rγ基因。

近年来，ZFNs法基因编辑技术被用于研究病毒-宿主相互作用，以及预防和治疗HIV-1感染。HIV和其他慢性病毒的感染过程具有隐伏性质，治疗这方面疾病需要一种生命周期长、可自我更新并具有多品系的造血干细胞，这类干细胞可以把耐感染的基因修饰细胞重新注入宿主体内[4]。

然而，分子合成的ZFNs并不总是可以产生高度特异的ZFNs产物。其缺陷在于细胞内标记基因常常会呈现毒理效应，且实施过程耗时[5]。

2 TALENs法基因编辑技术

2.1 TALENs的结构与作用机制 将DNA识别域TALEs和催化域 Fok I核酸酶进行人工偶联，创造出了TALENs法基因编辑技术[6]。TALEs起初是在植黄单胞菌植物病毒因子中被偶然发现的，这种病毒可将其蛋白转入宿主细胞并重新编辑宿主基因。TALE的DNA结合域包含33～35个氨基酸的重复单体，在该结合域的12/13位置上存在两个被称作重复可变双残基(repeat variable di-residues, RVDs)的高度可变氨基酸，它们决定了序列识别的特异性，其余的大部分重复单元相对保守。标记DNA的氨基酸重复单元和核苷酸序列呈一一对应的关系，独立单元不受相邻单元的影响。Fok I核酸酶可催化一条DNA链断裂。然而，当两个TALENs接到一段DNA侧翼时，Fok I域便发生二聚化，从而使双链DNA断裂[7]。

2.2 TALENs法基因编辑技术的应用 TALENs法基因编辑技术主要用途在于制造基因敲除的动物模型。该技术可直接在受精卵打靶目的基因，帮助研究者在两个月内获得纯合子敲除小鼠。最近一项特别的研究实现了三基因在小鼠体内同时打靶：研究者将 Agouti, miR-205和 Arf特异的TALEN混合体系注射进250颗受精卵，分散输送到10个代孕小鼠体内。获得43只幼崽， 鼠尾基因鉴定得到Agouti、miR-205和Arf突变的分别有25只、36和24只，其中 Arf 突变小鼠均可检测得到其他两种突变基因。证明TALENs可以同时打靶三个基因，高效繁殖出三基因突变的小鼠[8]。TALENs还可对人体细胞、胚胎干细胞或人体内诱导的多能干细胞系内基因位点进行打靶，形成包括敲除突变、敲入错义突变以及功能性移码突变在内的一系列突变。突变效率随细胞系和基因位点的变化而异。TALENs曾被用于人K562细胞内敲除CCR5基因，修饰效率范围为5%～27%。此外，TALENs具有良好的临床治疗潜力，白介素2受体γ( interleukin 2 receptor gamma, IL2RG)转座子突变可导致严重的伴X染色体免疫缺陷症，TALE-mediated修正IL2RG转座子的效率可达76%[9]。

TALENs具有巨大应用价值，但它所带来的毒副作用也不可忽略。TALENs毒性较ZFNs略小，转染后5天表达TALENs的细胞平均80%可以存活，而表达ZFNs的细胞平均只有50%存活率。毒副作用发生是因为TALENs与靶序列没有完全配对，导致基因组中不同位点的非特异性切割，这可能抑制重要的基因，从而扰乱基因组的稳定或引起细胞坏死。专性异源二聚体Fok I核酸酶替代常用内切酶Fok I也许可以减轻毒理效应。

3 CRISPR-Cas法基因编辑技术

3.1 CRISPR-Cas系统的分类及作用机制 成簇规律间隔短回文重复序列和相关Cas蛋白是一种适应性免疫系统，可保护原核生物免受感染性病毒和质粒侵害。这种防御系统依赖小型RNAs指导特异序列检测并沉默外源核酸。典型CRISPR基因座长20～50bp，两侧是腺嘌呤和胸腺嘧啶丰富的前导序列，中间为独立短间隔序列平均分隔的正向重复序列，间隔序列来源于入侵基因元件，也称原间隔序列(protospacers)。CRISPR/Cas介导的免疫发生分为三个阶段，适配阶段：细菌或古生菌对病毒或质粒入侵作出应答，将外源序列的短片段(原间隔序列)整合到宿主染色体的CRISPR阵列近末端；表达阶段：重复间隔元件转录成前体CRISPR RNAs(precursor CRISPR RNA, pre-crRNA)分子，接着被核酸内切酶加工成短的CRISPR RNA；干扰阶段：CRISPR RNAs与入侵病毒或质粒的互补原间隔序列配对，指导Cas蛋白沉默外源序列[10]。

根据标志基因的不同，CRISPR-Cas系统可分成3型。所有CRISPR-Cas系统均具有Cas1和Cas2基因。Cas1是金属依赖性酶，可以用序列非特异的方式切割双链和单链DNA，有些Cas1也能切割RNAs；许多Cas2蛋白是呈类铁氧还蛋白折叠状的RNA酶( RNases)，而嗜碱芽孢杆菌来源的Cas2是一种金属依赖的双链DNA酶(DNase)[11]。

3.1.1 I型CRISPR-Cas 系统 该型系统具有抗病毒的CRISPR相关复合物和Cas3。Cascade募集Cas3核酸酶降解靶序列。

3.1.2 II型CRISPR-Cas 系统 核糖核酸导向( RNA-guided)核苷酸内切酶Cas9出现后，人类构建的II型CRISPR-Cas系统是各型CRISPR-Cas系统中最简单的一种。

CRISPR-Cas9系统建立在以非编码RNA为导向的Cas9核酸酶基础之上。Cas9核酸酶来源于细菌和古生菌。Cas9技术实现了特定位点的DNA切割，可以较小的脱靶效率在基因组中任何部分(例如，编码区、启动子或者增强子)引入随机突变或靶突变[12]。CRISPR-Cas9系统中，两个非编码RNA(CRISPR RNA, crRNA)和(trans-activating crRNA, tracrRNA)发生表达，指导优化的哺乳动物Cas蛋白切割含间隔序列前体旁基序(protospacer adjacent motif, PAM)的靶向DNA双链[13]。一些基因工程体系中，crRNA 和 tracrRNA可形成一个共同的转录子——单导向RNA(single guide RNA, sgRNA)。靶序列以5′-NGG靠近PAM序列后，Cas9蛋白、tracrRNA和 sgRNA 表达形成复合物，结合靶序列并断裂DNA双链。DNA双链断裂对细胞有潜在致死性，存在两类修复机制：高效诱导非同源性末端结合(non-homologous end joining, NHEJ)作用下的突变和同源介导修复(homology-directed repair, HDR)。

3.1.3 III型CRISPR-Cas 系统 III 型CRISPR-Cas系统是所有各型CRISPR-Cas系统中最复杂的一种。Cas10基因编码蛋白和重复相关神秘蛋白( repeat associated mysterious proteins, RAMP)组块Csm或Cmr共同形成 Cas10-Csm或Cas10-Cmr靶向复合物。

3.2 CRISPR-Cas法基因编辑技术的应用 CRISPR-Cas 系统可促进携带多种突变基因动物的培育，还能推动有关基因家族和基因间相互作用的研究。2013年2月哈佛大学Church团队和麻省理工张峰团队相继发表用CRISPR-Cas法基因编辑技术，在小鼠和人类细胞中进行特定位点基因编辑的文章。2013年3月，麻省理工Jaenisch 团队利用CRISPR-Cas介导的基因编辑将小鼠胚胎干细胞中的五个基因同步破坏[3]。CRISPR-Cas9 已逐渐发展成为用于基因功能缺失(loss-of-function, LOF)研究的商业化技术，许多实验室开始用该技术来做基因组层面的功能缺失筛选[14]。

Cas9在植物细胞中同样可以发挥作用。中国科学院科学家证明，Cas9可破坏大米内源基因、原生质体以及小麦原生质体[15]。研究者通过U6 snRNA和NCURVATA2启动子表达的sgRNA以及Cas9 DNA内切酶在拟南芥植物核基因实现定向突变[16]。

细胞核内基因工程不仅能引领动植物基因功能研究的巨大进步，还可推动临床治疗方面的变革。CRISPR-Cas系统的一个令人振奋的潜在应用就是修改疾病造成的基因突变。CRISPR-Cas9基因编辑(即II型CRISPR-Cas系统)曾被用于纠正囊泡性纤维症人类细胞系的基因突变，还被用于改善肝细胞中乙酰水解酶基因突变造成的微量却致命的基因环境。CRISPR-Cas9 技术也有希望成为抵抗病毒感染的治疗手段。现已经实现活体内运用CRISPR-Cas9系统肝内清除乙肝病毒( hepatitis B virus, HBV)模板，证明CRISPR-Cas技术有潜力作为治疗手段根除病人体内顽固的HBV感染[17]。CRISPR-Cas9也可以破坏潜在HIV感染，保护机体不被新的HIV侵染，成为治疗或防御疾病的新技术[18]。

此外，通过修饰或灭活Cas蛋白还可以让CRISPR-Cas法基因编辑技术发展多方面的应用，特别是可进一步扩展在多种细胞株系和动物模型中的广泛应用。

4 结语

ZFNs, TALENs 和CRISPR-Cas法基因编辑技术已经能够帮助人类以更高的效率研究和创造疾病模型。尤其值得关注的是，CRISPR-Cas9作为一种新型的基因编辑技术在世界范围内得到了广泛的应用。随着高通量DNA测序和强大计算机算法的应用，包括人在内的许多有机体基因组序列都将会被精确地破译。相信在不远的将来，这项技术将使科学家具备前所未有的修饰有机体的能力，并在基础生物学和临床医学治疗研究方面发挥十分积极的作用并产生深远的影响。