天麻首乌片的HPLC指纹图谱研究*

苏文俏，彭艳梅，李跃辉，周润维，朱立华

(1.湖南省中医药研究院，长沙410013;2.湖南国华制药有限公司，长沙410013)

天麻首乌片的HPLC指纹图谱研究*

苏文俏1，彭艳梅1，李跃辉1，周润维1，朱立华2△

(1.湖南省中医药研究院，长沙410013;2.湖南国华制药有限公司，长沙410013)

目的:建立天麻首乌片的高效液相色谱指纹图谱。方法:采用Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.3%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱(0～18 min，5%～15%乙腈;18～32 min，15% ～26%乙腈;32～35 min，26% ～27%乙腈;35～48 min，27%～40%乙腈)，检测波长230 nm，柱温30℃，进样量10 μL，分析时间48 min。结果:根据10批样品建立了天麻首乌片的高效液相色谱指纹图谱，确定了18个共有峰，其中包含天麻、何首乌等6味药的特征峰。结论:该法灵敏度高，稳定性和重复性良好，且分析速度较快，可用于天麻首乌片的质量评价。

天麻首乌片;高效液相色谱法;指纹图谱

天麻首乌片是由天麻、白芷、何首乌、熟地黄、丹参、川芎、墨旱莲、女贞子、白芍、黄精、甘草、当归、桑叶、蒺藜(炒)共14味药组成，具有滋阴补肾、养血息风的功能，用于肝肾阴虚所致的头晕目眩、头痛耳鸣、口苦咽干、腰膝酸软、脱发、白发;血管神经性头痛、脂溢性脱发见上述证候者，对治疗头痛、头晕、脱发、白发的效果较为明显。中药指纹图谱方法已广泛用于中药的质量控制，它能更为全面地反映中药中化学成分的相对关系，从而对其进行整体描述和评价［1-2］。本试验中采用 HPLC建立天麻首乌片特征图谱色谱条件，并通过与药材的比较对色谱峰进行定位归属，以期为天麻首乌片的质量控制及评价提供一种较全面的分析手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津)，AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，HX-06型超声清洗器(武汉恒信世纪科技有限公司)，HH型恒温水浴锅(江苏金坛市中天仪器厂)。

1.2 试药

对照品二苯乙烯苷(批号110844-201310，按94.9%计)、芍药苷(批号110736-201337，按94.9%计)、天麻素(批号110807-201507，按95.4%计)、没食子酸(批号110831-201204，按94.9%计)、甘草苷(批号111610-201106，按93.7%计)均购于中国食品药品检定研究院，特女贞苷(批号 MUST-11040402，纯度≥98%)购于成都曼斯特生物科技有限公司，甲醇(分析纯，湖南汇虹试剂有限公司)，磷酸(分析纯，湖南汇虹试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，ACE)，水为娃哈哈纯净水，天麻、白芷、何首乌、熟地黄、丹参、川芎、墨旱莲、女贞子、白芍、黄精、甘草、当归、桑叶、蒺藜(炒)均购自于长沙老百姓大药房，天麻首乌片(批号分别为20151102、20151104、20151106、20151114、20151123、20151205、20151217、20151222、20160110、20160113)由湖南国华制药股份有限公司提供。

2 方法

2.1 色谱条件

Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)梯度洗脱，0～18 min，5% ～15%A，18～32 min，15% ～26%A，32～35 min，26%～27%A，35～48 min，27%～40% A。检测波长230 nm，流速1.0 mL·min－1，柱温30℃［3-5］，分析时间48 min。精密吸取上述溶液10 μL注入高效液相色谱仪测定［6］。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取二苯乙烯苷、天麻素、芍药苷、没食子酸、甘草苷、特女贞苷对照品适量置于容量瓶，加甲醇溶解制成浓度分别为0.04408、1.000、0.06900、10.40、0.02040、0.4400 mg·mL－1对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品约0.5 g精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定质量，加热回流提取30 min，取出放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀滤过，取续滤液即得。

2.2.3 药材溶液制备 称取天麻、何首乌、川芎对照药材各0.1 g，分别置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，回流提取30 min滤过，取续滤液即得。

精密称取白芷、熟地黄、丹参、墨旱莲、女贞子、白芍、黄精、甘草、当归、桑叶、蒺藜(炒)对照药材各5 g，按工艺水煮后定容至100 ml，精密吸取25 ml蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25 ml，即得。

3 结果与讨论

3.1 复方的色谱指纹图谱研究

3.1.1 方法学考察 (1)精密度试验:取样品约0.5 g(批号20151102)精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录色谱图，以二苯乙烯苷为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间RSD小于0.30%，相对峰面积RSD小于6.00%，表明方法精密度良好。

(2)重复性试验:取样品约 0.5 g(批号20151102)精密称定，平行6份按2.2.2项下方法平行制备6份供试液，在同一色谱条件下进样记录色谱图，以二苯乙烯苷为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间RSD小于0.76%，相对峰面积RSD小于7.50%，表明方法重复性良好。

(3)稳定性试验:取供试品(批号20151102)溶液于0、1、2.5、5、10、20 h进样分析，以二苯乙烯苷为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间RSD小于0.30%，相对峰面积RSD小于6.00%，表明方法在20 h内稳定性良好。

3.1.2 色谱指纹图谱的测定及相似性分析按2.2.2项下供试品溶液的制备方法处理10批供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，记录48 min的色谱图。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2.0版)》对10批样品的HPLC图进行多点校正、自动匹配(时间窗宽度为0.10)，用中位数法生成对照图谱R(即共有模式图，见图1)并计算相似度，结果显示10批样品特征峰的相似度均在0.9以上。

根据图1中10批样品HPLC图给出的峰数、峰面积积分值及相对保留时间，选取其中18个共有峰作为特征指纹峰(见图2)，并选择14号峰(二苯乙烯苷)作为参比峰(S峰)，计算各色谱峰的保留时间和峰面积比值，得到相对保留时间和相对峰面积平均值(结果见表1)。

图1 10批天麻首乌片HPLC特征图谱注:S1.二苯乙烯苷对照品;S2.甲醇溶剂;S3～S12.10批样品;R.对照图谱

3.1.3 色谱峰归属分析 取天麻、白芷、何首 乌、熟地黄、丹参、川芎、墨旱莲、女贞子、白芍、黄精、甘草、当归、桑叶、蒺藜(炒)药材溶液，按上述色谱条件依次进样、测定，将样品与各单味药的HPLC色谱图进行比对(见图3)辨识与归属可知，1、8、12号峰为天麻的特征峰，14号峰为何首乌的特征峰，5、17号峰为丹参的特征峰，6、7、13、15号峰为女贞子的特征峰，10、11号峰为白芍的特征峰，2号峰为炒蒺藜的特征峰。其中1号峰为天麻素，3号峰为没食子酸，11号峰为芍药苷，13号峰为甘草苷，14号峰为二苯乙烯苷，15号峰为特女贞苷。

图2 天麻首乌片HPLC指纹图谱共有模式

图3 天麻首乌片与单味药HPLC特征图谱的比较注:S1.天麻;S2.白芷;S3.何首乌;S4.熟地黄;S5.丹参;S6.川芎;S7.墨旱莲;S8.女贞子;S9.白芍; S10.黄精;S11.甘草;S12.当归;S13.桑叶;S14.炒蒺藜;S15.天麻首乌片

表1 HPLC指纹图谱特征峰相对保留时间、相对峰面积及归属

4 讨论

4.1 本试验中考察了多种流动相系统，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.5%冰醋酸溶液。结果表明，以乙腈-0.3%磷酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱时各个峰的分离效果较好，且基线相对平稳［7-8］。天麻首乌片药味多、成分复杂，以某单一成分的最大吸收波长为检测波长无法体现所有成分的特征，故对220 nm、230 nm、254 nm、280 nm、320 nm波长下的色谱图进行分析［9-11］，结果显示220 nm、230 nm波长下色谱峰的个数最多，而220 nm接近甲醇溶剂的截止波长，故选择230 nm作为特征图谱的检测波长。

4.2 研究过程中，还考察了不同提取溶剂对样品的提取效果，以乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇作为提取溶剂提取样品。通过色谱图的比较发现，各方法对应色谱图中特征峰个数一致。但以甲醇为提取溶剂的样品所对应的色谱图峰形较好，故选择甲醇作为样品提取溶剂。

4.3 本实验进行了复方HPLC指纹图谱研究，标定了18个共有峰，对这18个共有峰进行了药味归属，初步阐明了共有峰的来源，其中天麻、何首乌、丹参、女贞子、白芍、炒蒺藜6味药在样品特征图谱上可对应到其特有的成分信息，通过与对照色谱图对比的方法，定性了部分色谱峰，另有2个色谱峰未能进行归属，有待进一步的研究。

［1］陈振华，刘苏珍，周斌，等.浅谈中药质量标准现状与几种质量评价方法［J］.时珍国医国药，2016，27(3):694-696.

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［6］国家药典委员会.中国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2015:176.

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Research on chromatographic fingerprints of Tianmashouwu Tablets by HPLC

SUN Wen-qiao1，PENG Yan-mei1，LI Yue-hui，ZHOU Run-wei1，ZHU Li-hua2△

(1.Traditional Chinese medicine research institute of hunnan province，Changsha，410013，China; 2.Hunan guohua pharmaceutical CO.，LTD.，Changsha，410013，China)

Objective To establish the HPLC chromatogram fingerprints of Tianmashouwu Tablets.Methods:The chromatographie fingerprints were obtained through Kromasil C18 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)with the gradient elution solvent system composed of acetonitrile-0.2%phosphoric acid(0～18 min，5% ～15%acetonitrile;18～32 min，15%→26%acetonitrile;32～35 min，26% ～27%acetonitrile;35～48 min，27% ～40%acetonitrile).The detective wavelength was set at 230 nm;the flow rate was 1.0 m L/min;the column temperature was maintained at 30℃ and the injection volume was 10 μL;the analysis time was 120 min.Results The HPLC characteristic chromatogram was built on basis of 10 batches of Tianmashouwu Tablets，including 18 common peaks which contain the characteristic peaks of 6 Chinese herbal medicines，such as Gastrodia elata Bl，Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.，etc.Conclusion:The established HPLC fingerprint has high is a reliable，available and quick method，which can be used in the quality evaluation of Tianmashouwu Tablets.

Tianmashouwu Tablets;HPLC;chromatogram fingerprints

R692.4

B

1006-3250(2016)11-1534-04

2016-04-27

苏文俏(1991-)，女，在读硕士，从事中药学的临床与研究。

△通讯作者:朱立华(1964-)，男，副研究员，从事企业管理与中药生产研究，Tel:13907312798，E-mail:380565887@qq.com。