三种针法对PCPA失眠大鼠海马5-HT、5-HIAA含量的影响*

罗本华，王 燕，张亚飞，罗梅桂

(广西中医药大学，南宁 530001)

三种针法对PCPA失眠大鼠海马5-HT、5-HIAA含量的影响*

罗本华，王 燕，张亚飞，罗梅桂

(广西中医药大学，南宁 530001)

目的:观察针刺失眠方、脐内环穴及失眠方合脐内环穴对PCPA失眠大鼠海马5-HT、5-HIAA含量影响，并对3种针法优选。方法:70只大鼠经随机、PCPA失眠造模及筛选后共分6组各10只，正常组、模型组无特殊处理，3个观察组分别给予针刺失眠方、针刺脐内环穴、针刺失眠方合脐内环穴干预，非穴组给予针刺非穴处理，治疗6 d后取大鼠海马匀浆，ELISA法检测5-HT和5-HIAA含量。结果:PCPA模型大鼠海马5-HT和5-HIAA明显降低，3种针法均显著升高5-HT、5-HIAA含量;而失眠方合脐内环穴针刺作用更好，优于2种单一方法并显示其叠加作用。结论:3种针法可能通过升高海马内5-HT、5-HIAA含量而改善失眠，实验支持失眠方合脐内环穴针刺为失眠症的优选干预方法。

失眠;脐内环针;失眠方;5-HT;5-HIAA

5-羟色胺(5-HT)在睡眠的调节过程中起着重要作用，是睡眠机制研究的重点之一。针刺失眠方、脐内环穴针刺是流行于广西地域治疗失眠症临床常用且有效的方法。笔者近年常用二者结合治疗失眠症，取得较好的疗效。为了解其对睡眠活动的调节机理，探讨了3种针刺方法的差异。本实验研究3种针刺对PCPA失眠模型大鼠海马5-HT和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量影响，旨在为其临床运用、方法优选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物 健康SPF级Wistar雄性大鼠70只，体质量(250±15)g，由广西医科大学动物实验中心提供;室温20～25℃饲养，室内采光按照白昼循环模式，定时喂食，自由饮水，适应性喂养15 d。

1.1.2 试剂 对氯苯丙氨酸(PCPA)试剂盒:美国Alfa Aesar(批号H30Y014);大鼠5-HT ELISA试剂盒、大鼠5-HIAA ELISA试剂盒:武汉基因美生物科技有限公司(批号201501、201501)。

1.1.3 仪器 低温高速离心机:SIGMA3-18K，德国 Sigma公司产品;Bio-Tek 800酶标仪:美国BIO-RAD公司产品;洗板机:芬兰 (Thermo Labsystems)公司产品;培养箱:HH.CP-01W;匀浆仪FLUKO-PRO200。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 采用随机数字表法将70只Wistar大鼠分为正常组10只、预用模型复制大鼠60只。预用模型复制大鼠采用腹腔注射对氯苯丙氨酸法(PCPA)进行模型复制，筛选后将造模成功的50只大鼠按随机数字表法分为模型组、针刺失眠方组、脐内环针组、失眠方加脐内环针组、非穴组5组各10只。

1.2.2 PCPA失眠模型制作 对氯苯丙氨酸(PCPA)，临用前按大鼠45 mg/(1 ml·100 g)用量，用弱碱性生理盐水(pH 7～8)配置成混悬液备用。于上午8∶00左右将大鼠按1 ml/100 g剂量腹腔注射PCPA混悬液，每日1次，连续注射2 d，在第2次腹腔注射PCPA 28～30 h后，动物出现昼夜节律消失，白天活动不停，整体观察与正常组有明显不同者，表明模型复制成功。正常组腹腔注射相同体积的弱碱性生理盐水。

1.2.3 针刺干预方法及疗程 6组于造模成功后次日开始实验干预治疗。

(1)正常组与模型组不给予任何治疗，只给予同脐内环针组相同时间(4 min)及相同强度的抓摸刺激;(2)针刺失眠方组给予针刺失眠方穴治疗。取穴［1］:双侧神门、支沟、足三里、三阴交。大鼠的神门在前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，直刺1 mm;三阴交在后肢内踝尖直上10 mm，直刺5 mm;足三里即后三里在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处，直刺7 mm;支沟穴在前肢外侧，距腕关节4.5 mm左右的尺桡骨间，直刺1 mm。针刺方法:以25× 13 mm粗细的毫针刺入穴位相应的深度，针后行捻转角度90°以内90～180次/min的高频小幅度捻转手法，每穴行30 s后出针，每次共治疗4 min;(3)脐内环针组给予针刺脐内环穴治疗。取穴:脐内环穴，取心肝脾肺肾6个穴点。脐内环穴在大鼠神阙穴［1］旁开2.5 mm处做一圆环，环线上均是穴位(据上书神阙至中脘约20 mm拆算);以正上方为心，正下方为肾，右为肝，左为脾胃，左上、右上均为肺，共6个穴点。针刺方法:以25×13 mm粗细的毫针，由内向外以10～15°刺入2～4 mm，针后不行捻转提插手法，每穴点留针30 s共3 min;继续抓摸1 min，每次共治疗4 min;(4)失眠方加脐内环针组给予以上失眠方针刺加脐内环针刺治疗，每穴行30 s后出针，共治疗7 min;(5)非穴组针刺双侧肋下各2个固定非穴点［2］，约相当于乳正中线外开2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm，每穴行90 s后出针，继续抓摸1 min，每次共4 min。以上6组按相应干预方法，每日治疗1次共6次。

1.2.4 大鼠海马取材方法 针灸干预方案完成后第2天即处死各组动物，开颅迅速取出整脑，冰上分离各组大鼠海马，冷生理盐水中洗去血液，电子天平上称重后置于－80℃冰冻保存备用待测。

1.2.5 大鼠海马5-HT、5-HIAA含量检测 取海马组织按1∶9比例加入0.9%氯化钠溶液，组织匀浆器低温下匀浆，4℃、3000 r/min离心20 min，取上清置于-20℃保存待测。采用双抗体夹心法检测5-HT、5-HIAA含量。按试剂盒说明书设立标准品孔、样品孔和空白对照孔，标准品孔加入不同浓度的标准品50 μl。样品孔先加待测样本10 μl，再加样本稀释液40 μl。标准品孔和样本孔每孔加入辣根酶标记抗体10 μl，37℃水浴锅温育60 min，后洗板5次，吸水纸拍干。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。加入终止液50 μl。450 nm波长测定各孔的吸光度(OD)值。计算机根据各标准品吸光度以及标准品浓度，计算检测样品5-HT、5-HIAA的含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 各组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量(ng/ml，±s)

表1 各组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量(ng/ml，±s)

注:与正常组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与失眠方加脐内环针组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例数5-HT 5-HIAA正 常 组10 129.7±22.2 66.2±10.7模 型 组 10 77.7±25.4##＊＊ 38.7±11.1##△△＊＊针 刺 失 眠 方 组 10 101.4±28.3#△＊ 55.8±12.9##△＊脐 内 环 针 组 10 101.6±29.2#△＊ 54.2± 6.6##△＊失眠方加脐内环针组 10 125.4±24.8△△ 63.7±12.5△△非 穴 组 10 86.0±23.0##＊＊ 44.1± 9.7##△△＊＊

表1显示，模型组PCPA失眠大鼠海马5-HT、5-HIAA含量均显著低于正常组大鼠(P＜0.01);针刺失眠方组、脐内环针组及失眠方加脐内环针组5-HT、5-HIAA含量均显著高于模型组大鼠(P＜0.05);而失眠方加脐内环针组5-HT、5-HIAA含量均显著高于其他针刺组(均P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

失眠的病机关键为水火失调、阴阳失衡。失眠穴方是治疗失眠症的针刺验方［3］，主穴为神门、支沟、足三里、三阴交，立意泻火补水，是针对失眠水火失调病机而设。脐内环针是壮医针刺的基础针法和调气方法，而脐内环穴五脏点同取法是壮医针刺颇具疗效和研究基础的失眠效方;究其理，脐内环穴位于脐旁开0.5寸，能沟通任冲和调节先天后天;脐是机体三部人部所在，是脏腑信息全息处，结合针向迎随，能调理全身脏腑和气血;脐通五脏之神，善调五脏之气，又起最基本的调气调神作用，因而针刺脐内环穴能整体调理脏腑阴阳气血神气，广泛用于全身诸多疾病的整体调理。数年来，笔者验证了单用脐内环五脏点同取法［4］和失眠穴方［3］针刺治疗失眠症的疗效，发现二者结合针刺［5-6］疗效更优，并确立其为失眠症的研究方法，这样既能有效地发挥脐内环针整体治神调气和近部脏腑调节的作用，又发挥失眠穴方肢体经穴的远治作用，更整体而全面地顾及失眠症的脏腑经络调节、水火阴阳平衡。

睡眠发生与睡眠－觉醒机制相关的中枢神经递质含量发生改变密切相关［7］。5-HT是公认的参与睡眠－觉醒机制的神经递质，对慢波睡眠的发生和维持起重要作用，是脑内的“致眠因子”［8］。5-HIAA是脑内5-HT的代谢产物，其含量的增加表达了5-HT的合成和代谢的加强［9］，故脑内5-HT递质及5-HIAA含量的变化是反映大鼠失眠发生的指标之一。PCPA是5-HT合成抑制剂，腹腔注射PCPA能造成睡眠昼夜节律消失，达到完全失眠，故PCPA失眠大鼠模型是目前公认的、广泛地用于失眠症中枢5-HT递质研究的经典动物模型。中枢5-HT能神经元胞体大部分位于网状结构的中缝核群，其纤维投射到丘脑、下丘脑、海马、基底神经节和大脑皮层。海马在睡眠－觉醒的调节中起重要作用［10］。本实验结果显示，模型组大鼠海马5-HT、5-HIAA含量较正常组大鼠显著性降低，说明实验PCPA失眠大鼠模型复制成功;而针刺失眠穴方、脐内环针刺和二者结合针刺均显示，有升高PCPA失眠大鼠海马5-HT、5-HIAA含量的作用，从而恢复PCPA所致失眠大鼠的睡眠－觉醒周期，提示该3种针法均对失眠症有效;而二者结合针法显示了明确的叠加作用，优于2种单一方法，故本实验支持其为失眠症治疗的优选方法。

综上，3种针法均可能通过升高海马5-HT、5-HIAA含量起到治疗失眠的作用，实验支持针刺失眠穴方合脐内环穴方法为失眠症的优选干预方法。

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Study of Three Aupuncture Methock on Affecting the Content of 5-HT，5-HIAA in Hippocampal of PCPA Insomnia Rats

LUO Ben-hua，WANG Yan，ZHANG Ya-fei，LUO Mei-gui

(Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China)

Objective:To observe the three acupuncture methods on affecting the content of 5-HT，5-HIAA in hippocampal of PCPA insomnia model rats of the acupuncture of umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupointprescription，and to select the optimal acupuncture method.Methods:After being randomed，PCPA insomnia modeled，insomnia screened on the 70 male rats，the resulted 60 rats were randomly divided into six groups，and each group were 10.The normal group and the model group were given no special treatment，the three observation group were given acupuncture treatment of the umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription respectively.The non-acupoint group was dealed with acupuncture non-acupoint.After six days of treatment，in the hippocampus homogenates of the rats，the content levels of 5-HT and 5-HIAA were detected by enzyme-linked immunoassay.Results:The contents of 5-HT，5-HIAA in hippocampal of PCPA insomnia model rats were significantly reduced.Three acupuncture methods can improve the 5-HT and 5-HIAA contents in hippocampal of rats.Their combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription displayed a better effective increasing the content of 5-HT，5-HIAA than each single method of acupuncture and showed an additive effect.Conclusion:Three acupuncture methods might take affect on insomnia by the mechanism of improving the contents of 5-HT and 5-HIAA in hippocampal.The experiment suggested that the combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription therefore was the preferred acupuncture.

Primary insomnia;The acupuncture of umbilical inner acupoints;The acupoint-prescription of insomnia; 5-HT(Serotonin);5-HIAA

R245.3

B

1006-3250(2016)11-1517-03

2016-05-20

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019133，桂财教［2013］19号)

罗本华(1968-)，男，湖南邵阳人，主任医师，医学博士，从事中医及壮医针灸防治神经系统疾病的基础与临床研究。