“髓减致痿”病机的实验研究*

胡华刚，陶 黎，吴佳莹，赵宏艳，汪文来，于 峥，刘 红，潘静华，李 艳，王少君，张治国，刘梅洁，鞠大宏1，

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

“髓减致痿”病机的实验研究*

胡华刚1，2，陶 黎2，吴佳莹2，赵宏艳3，汪文来2，于 峥2，刘 红3，潘静华3，李 艳3，王少君3，张治国2，刘梅洁3Δ，鞠大宏1，3Δ

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

目的:通过动物实验探讨中医“髓减致痿”病机的科学性。方法:将60只大鼠按随机数字表法分为空白对照组、假手术组、模型组、阳性对照组、补肾组5组，切除大鼠双侧卵巢制作骨质疏松症模型。阳性对照组灌胃给予戊酸雌二醇，补肾组灌胃给予左归丸，连续给药3个月。采用Micro CT检测股骨BV/TV(%)，骨计量学方法检测胫骨骨组织形态。结果:与假手术组比较，模型组大鼠骨丢失率显著增加，股骨BV/TV以及胫骨TBV%均显著减少，而TRS%、TFS%及其TRS/TFS显著增加;同时髓腔中出现大量脂肪细胞，ABS%显著增加，而其他骨髓细胞相对减少。而给予左归丸和戊酸雌二醇后，上述指标在一定程度上发生逆转。结论:切除大鼠卵巢3个月后，在骨量显著丢失的同时，骨髓中脂肪细胞大量增多而其他骨髓细胞明显减少，而补肾能在一定程度上抑制这一情况的发生，证明了中医“髓减致痿”病机的科学性。

髓减致痿;骨痿;骨质疏松症;脂肪细胞

骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴。中医理论认为，肾藏精主骨生髓，精足则髓足，骨骼得养则强健有力;精亏则髓减，骨失其养则脆弱易折，就会发生“骨痿”，即骨质疏松症。本研究拟采用动物实验，从现代医学角度探讨中医“髓减致痿”理论的科学性，并为中医“肾主骨”理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠60只，体质量(210±10)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号 SCXK-(军) 2007-004)，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物室(实验动物使用许可证号 SYXK (京)2010-0032)。

1.1.2 药物 左归丸药液组成:熟地24 g，山药12 g，山萸肉12 g，莬丝子12 g，枸杞子12 g，川牛膝9 g，龟板胶12 g，鹿角胶12 g。常规水煎减压浓缩，制备成浓度为0.968 g生药/ml的药液。戊酸雌二醇:拜耳医药保健有限公司广州分公司产品(批号234A，1 mg/片)。临用时，将戊酸雌二醇碾碎后，用纯净水制成浓度为0.0092 mg/ml的混悬液。

1.1.3 主要试剂和仪器 主要试剂:甲基丙烯酸甲酯为天津市福晨化学试剂厂产品(批号20130407);甲基丙烯酸丁酯为国药集团化学试剂有限公司产品(批号20120411);苯甲酸甲酯为天津市光复精细化工研究所产品(批号20100115);聚乙二醇400为国药集团化学试剂有限公司产品(批号20120714);过氧化苯甲酰为国药集团化学试剂有限公司产品(批号T20090409);N，N-二甲基对甲苯胺为ALDRICH公司产品(批号04327MB-235)。

主要仪器:Skyscan1174 Micro-CT(比利时，Bruker公司);Reicheit-Jung2040切片机(德国，Leica公司);DM 6000B正置显微镜(德国，Leica公司); Qwin Pro V3.5.0图像分析系统(德国，Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将60只SD雌性大鼠以体质量按随机数字表法分为空白对照组12只，假手术组12只，造模组36只。造模组大鼠按照文献［1］方法切除大鼠双侧卵巢，假手术组仅摘除卵巢附近的部分脂肪组织但不摘除卵巢。术后10 d，再将造模组36只大鼠以体质量按随机数字表法分为模型组、阳性对照组及补肾组各12只。然后开始灌胃给药，补肾组灌胃给予0.968 g生药/ml的左归丸药液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为9.68 g生药/kg体质量;阳性对照组给予0.0092 mg/ml的戊酸雌二醇混悬液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为0.092 mg/kg。每天灌胃1次，连续6 d，休息1 d再给药6 d，如此连续给药3个月。每周称重1次，据此调整给药量。空白对照组、假手术组和模型组按上法给予等体积的纯净水。

末次给药后，将各组大鼠用戊巴比妥钠(45 mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，然后迅速处死。取右侧胫骨及股骨4%多聚甲醛固定，分别用于不脱钙骨切片制作和Micro CT检测。

1.2.2 指标检测方法 (1)Micro CT检测。采用Micro-CT对各组大鼠的股骨进行扫描。将大鼠右侧股骨从固定液中取出后置于生理盐水中浸泡，为防止扫描过程中样本出现脱水和移位，扫描时将股骨用浸有生理盐水的湿纸巾包绕后放到样本管中，固定在Micro CT载物台上。电压50 kV，电流800 μA，以180°扫描角度、12 μm扫描分辨率、1304× 1024视野大小沿股骨长轴方向对股骨远端进行扫描。将生长板下1mm定为扫描参考线，扫描参考线以下1.5 mm的区域设定为三维重建兴趣区域(range of interests ROI)，用N-Recon软件进行骨小梁三维图像重建，用CT-AN软件进行三维分析，获得骨体积分数BV/TV(%)，即所选区域内骨小梁总体积与样本总体积之比;(2)骨组织形态计量学指标检测。取右侧胫骨近端1/3去除软组织，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，塑料包埋。在 Reicheit-Jung 2040切片机上，用钨钢刀分别切出5 μm的纵向不脱钙骨切片，甲苯胺蓝染色。

参照文献［2］所述方法，采用Qwin Pro V3.5.0图像分析系统，对不脱钙骨切片的以下指标进行计量:①骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比是衡量骨量水平的主要标志;②骨小梁吸收表面百分比(TRS%):凹凸不平、不规则的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比:③骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比。骨丢失率(%)=(每只大鼠的TBV%值－空白对照组大鼠TBV%平均值)/空白对照组大鼠TBV%平均值× 100%。骨丢失率为正值时表示骨量增加，绝对值越大表示骨量增加越多;为负值时，表示骨量丢失，绝对值越大表示骨量丢失越多［3］。骨髓腔内脂肪细胞体积百分比(ABS%):骨髓腔内脂肪细胞的面积占被测骨髓腔面积的百分比。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(±s)表示，正态分布采用单因素方差分析，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis 1-way ANOVA(k samples)检验。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨BV/TV的变化

表1图1比较，与假手术组比较，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠股骨的BV/TV显著减少;与模型组比较，补肾组和阳性对照组大鼠股骨的BV/TV值显著增加。

表1 各组大鼠股骨BV/TV变化比较［例(%)］

2.2 各组大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的变化

表2显示，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的TBV%显著低于假手术组;而补肾组和阳性对照组的TBV%显著高于模型组。与假手术组比较，模型组、补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的骨丢失率(绝对值)显著增加;而与模型组比较，补肾组和阳性对照组的骨丢失率(绝对值)显著减少。

图1 各组大鼠股骨骨小梁三维重建图注:a-e分别代表空白对照组、假手术组、模型组、阳性对照组和补肾组的骨小梁三维重建图

表2 各组大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的变化

2.3 各组大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS的变化

模型组、补肾组和阳性对照组与假手术组比较，大鼠胫骨TRS%、TFS%和TRS/TFS均显著增加;而与模型组比较，补肾组和阳性对照组的3个指标均显著减少。

表3 各组大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS的变化

2.4 各组大鼠骨髓腔中脂肪细胞变化

2.4.1 光镜下观察 图2显示，模型组大鼠胫骨骨小梁较空白对照组和假手术组显著减少，其排列稀疏，间距加宽，小梁之间连接差。髓腔中的脂肪细胞呈圆形或类圆形的空泡状，模型组中的脂肪细胞较空白对照组和假手术组显著增多，而其他骨髓细胞相对减少。补肾组和阳性对照组的骨小梁较模型组明显增多，而脂肪细胞明显减少，其他骨髓细胞相对增多。

2.4.2 各组大鼠胫骨骨髓腔中ABS%的变化

表4显示，与假手术组比较，模型组、阳性对照组和补肾组大鼠胫骨骨髓腔中ABS%显著增加;与模型组比较，补肾组和阳性对照组ABS%显著减少。

表4 各组大鼠胫骨骨髓腔内ABS%的变化

与空白对照组比较，假手术组的上述指标均未发生明显改变，从而排除了手术因素对实验的影响。

3 讨论

骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴［4］。“骨痿”之名首见于《黄帝内经》。《素问·痿论》云:“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”;“肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”明确指出“髓减”“髓虚”是导致“骨痿”的重要原因。中医理论认为，肾藏精主骨生髓。如《素问·六节脏象论》:“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也……其充在骨”;《素问·阴阳应象大论》:“肾生骨髓”;《素问·痿论》:“肾主身之骨髓”，都将肾-精-髓-骨的生理功能紧密结合在一起。正如《中西汇通医经精义》所言:“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之合也。髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”由此可见，肾实精足则骨髓生化有源，骨髓充足骨得以充分滋养而坚固有力;若肾虚精少、骨髓化生乏源、骨髓减少、骨乏其养就会导致骨痿［5］。综上所述，“髓减”是“骨痿”发生的基本病机，所以历代医家治疗骨质疏松症多从补肾入手，将“补肾益精生髓”作为治疗该病的基本大法。

本研究结果显示，大鼠切除卵巢后骨丢失显著增加，BV/TV以及TBV%显著减少;而代表骨吸收指标的TRS%和TRS/TFS以及代表骨形成指标的TFS%均显著增高，说明卵巢切除所造成的是一种骨吸收和骨形成均增高，但由于骨吸收大于骨形成，进而导致骨量丢失的高转换型骨质疏松症。病理观察显示，模型组大鼠胫骨骨小梁较假手术组显著减少，其排列稀疏、间距加宽发生“骨痿”。同时，髓腔中的脂肪细胞较假手术组显著增多，而其他骨髓细胞相对减少。形态计量结果进一步显示，模型组TBV%显著减少的同时，其ABS%显著增高。脂肪细胞的显著增多，导致其他骨髓细胞明显减少，即出现了“髓减”。这一结果说明，“髓减”与“骨痿”之间存在着密切联系。而采用左归丸补肾后，在骨小梁明显增多的同时，髓腔中ABS%明显下降，即髓腔中的脂肪细胞明显减少，而骨髓细胞明显增多，从而进一步证明中医“髓减致痿”病机的正确性，同时也说明“肾主骨”理论的科学性。

现代研究表明，大鼠脂肪基质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有多向分化潜能，在体外经诱导剂诱导后显示出较强的成骨分化能力。雌二醇可促进ADSCs的增殖，并能提高其向成骨细胞分化的能力［6-8］。本实验结果显示，去卵巢大鼠补充雌二醇后骨髓中的脂肪细胞明显减少，而其他骨髓细胞明显增多，从而说明雌激素在诱导脂肪基质干细胞向其他骨髓细胞的转化过程中起重要作用，给予去卵巢大鼠左归丸后也产生了同样的结果。据此推测，补肾可能有促进脂肪基质干细胞向成骨细胞分化的能力，进而使脂肪细胞明显减少，而使其他骨髓细胞相应增加，即通过“增髓”而达到治疗“骨痿”的作用，对此还有待进一步的深入研究。

［1］鞠大宏，张丽坤，赵红艳，等.滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠骨髓基质细胞IL-1和成骨细胞IL-6表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11(7):495-498.

［2］章明放，张乃鑫，谭郁彬.运动对雌性大鼠去势后骨质疏松症的作用［J］.中华骨科杂志，1994，14(6):365-369.

［3］ 付小卫，宋长恒，张治国，等.从OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路探讨“肾主骨”的性别差异及其机制［J］.中国中医基础医学杂志，2016，22(1):66-72.

［4］辛小玲，李兆弟，于峥，等.骨痿的病因病机［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18(5):470.

［5］赵红霞，于智敏，鞠大宏，等.骨质疏松症的中医证候病机研究［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14(10):723-724.

［6］陈昕，丁寅，蔡川，等.雌激素对老年大鼠脂肪干细胞体外诱导成骨能力的影响［J］.口腔医学研究，2010，26(3): 340-342.

［7］MURUGANANDAN S，SINAL CJ.The impact of bone marrow adipocytes on Osteoblast and Osteoclast Differentiation［J］.IUBMB Life，2014，66(3):147-155.

［8］ MURUGANADAN S，ROMANAA，SINALCJ.Roleof chemerin/CMKLR1 signaling in adipogenesis and osteoblastogenesis of bone marrow stem cells［J］.J Bone Miner Res，2010，25(2):222-234.

Experimental Research of Etiology of“Decrease of Marrow Leading to Bone Debility”

HU Hua-gang1，2，TAO Li2，WU Jia-ying2，ZHAO Hong-yan3，WANG Wen-lai2，YU Zheng2，LIU Hong3，PAN Jing-hua3，LI Yan3，WANG Shao-jun3，ZHANG Zhi-guo2，LIU Mei-jie3Δ，JU Da-hong1，3Δ

(1.Postdoctoral Research Station，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2.Institute of Basic Theory for Chinese medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3.Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:Exploring the scientific nature of Traditional Chinese Medicine etiology of“decrease of marrow leading to bone debility”by animal experiments.Methods:SD female rats were randomly divided into blank control group，sham operation group and ovariectomized model group according to their body weights.After the operation，the model group were randomly divided into OVX group，aquadiol group and Zuogui pill group.For three consecutive months administration，rats were sacrificed and then the tibia and femur were fixed with paraformaldehyde.Longitudinal undecalcified bone sections and toluidine blue staining would be made，and bone tissue morphology and adipocyte volume percentage(ABS%)would be measured.The BV/TV(%)of femur was measured by Micro CT.Results:Compared with the sham operation group，TBV%and BV/TV of ovariectomized model group were significantly decreased，while its values of ABS%，TRS%，TFS%and TRS/TFS were evidently increased.At the same time，a large number of adipocytes appeared in the bone marrow cavity of OVX group rats，but other marrow cells were relatively reduced.After administration of Zuogui pill or estradiol valerate，the above indexes have been reversed in a certain extent.Conclusion:After three months of ovarian resection in rats，bone mass and other marrow cells of OVX group rats shin were reduced significantly while a large number of adipocytes increased in bone marrow.However，Tonifying Kidney could inhibit the occurrence of above situation in a certain extent.This experiment proved the Traditional Chinese Medicine etiology of“decrease of marrow leading to bone debility”was scientific.

Decrease of marrow leading to bone debility;Bone debility;Osteoporosis;Adipocytes

R228

B

1006-3250(2016)11-1469-03

2016-05-13

国家自然科学基金面上项目(81473551)－“髓减致痿”病机的实验研究

胡华刚(1983-)，男，山东济宁人，博士后，从事传统医药治疗痹症的基础研究。

△通讯作者:鞠大宏(1963-)，男，辽宁凤城人，研究员，医学博士，博士后合作导师，从事中医防治痹症(类风湿关节炎和骨质疏松症)的临床与基础研究，Tel:010-64089025，E-mail: judahong@sohu.com;刘梅洁(1981-)，女(回族)，河南南阳人，副研究员，医学博士，从事中医药防治骨质疏松症的基础研究，Tel:010-64089023，E-mail:liumeijie811@163.com。