姜黄素对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP－2活性和血脑屏障通透性的影响

王一凡　杨霄鹏　曾志磊　白宏英　娄季宇　(郑州大学第二附属医院神经内科，河南　郑州　450014)



姜黄素对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP－2活性和血脑屏障通透性的影响

王一凡杨霄鹏曾志磊白宏英娄季宇(郑州大学第二附属医院神经内科，河南郑州450014)

〔摘要〕目的探讨姜黄素降低脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性及减轻脑水肿的作用及机制。方法将90只SD大鼠随机分为假手术组( n=30)、缺血再灌注组( n=30)、姜黄素治疗组( n=30)。以线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，腹腔注射姜黄素，各组于脑缺血再灌注后24 h、48 h、96 h用免疫组织化学方法观察损伤侧脑组织基质金属蛋白酶( MMP)－2活性及层黏连蛋白表达的变化。比色法测定损伤侧脑组织含有伊文思蓝( EB)的量，动态观察该侧血脑屏障通透性变化。结果随着缺血再灌注时间逐渐延长，MMP－2表达能力、EB含量均逐渐增加，48 h达峰，层黏连蛋白的表达逐渐下降，各组之间表达具有统计学差异( P＜0．05) ;姜黄素治疗组MMP－2表达、EB含量在各个时间点明显低于缺血再灌注组，同时层黏连蛋白的表达增加( P＜0．05)。结论姜黄素可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠MMP－2的表达，增加层黏连蛋白的表达，降低血脑屏障通透性，从而减轻脑水肿。

〔关键词〕姜黄素;基质金属蛋白酶－2;层黏连蛋白

缺血性脑血管病发生后，急性期动脉溶栓治疗后易出现脑水肿，进而对脑组织造成的损害加重，就是脑缺血再灌注损伤〔1〕。研究表明血脑屏障( BBB)的通透性与基质金属蛋白酶( MMP)－2之间存在较为密切的关联〔2〕，血管基底膜的层黏连蛋白能被其降解而引发脑水肿。姜黄素为天南星科植物的根蓋中提取的一种二酮多酸类化合物，对缺血、缺氧后的神经组织损害具有保护作用〔3〕，其机制是否为通过抑制MMP－2和层黏连蛋白的表达来影响BBB通透性而发挥作用目前尚不能明确。此次研究拟了解姜黄素在治疗脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制，也为其临床应用提供更多理论支持。

1材料与方法

1. 1实验对象及分组由郑州大学动物中心提供的雄性SD成年大鼠90只，体重250～300 g。随机分为假手术组、缺血再灌注组、姜黄素治疗组，每组30只。各组每次取5只大鼠分别于处理后24 h、48 h、96 h测定其MMP－2、层黏连蛋白免疫组化结果;分别于上述不同时间点各组再各取5只，进行BBB通透性的研究。

1. 2药物及试剂姜黄素购自美国Cayman Chemical公司，MMP－2兔多克隆抗体、层黏连蛋白兔多克隆抗体购自武汉博士德公司，二氨基联苯胺( DAB)试剂盒、SP9000试剂盒、伊文思蓝( EB)、甲酰胺溶液等购自北京中杉生物工程公司。

1. 3给药方法假手术组不予给药，姜黄素治疗组于缺血前1 h给予腹腔注射姜黄素50 mg/kg，缺血再灌注组则于同时给予等剂量溶媒腹腔注射。

1. 4实验动物模型的建立拟参照Zea longa线栓法〔4〕加以改良建立大鼠缺血再灌注模型。首先称重并麻醉大鼠，颈部正中切口，分离出大鼠左侧颈总动脉( CCA)、左侧颈内动脉( ICA)和颈外动脉( ECA)。结扎CCA、ECA根部，于CCA分叉处剪一小口插入一根尼龙渔线(渔线头段烧成球状)，遇阻力后停止，扎紧并固定栓线，缝合皮肤。缺血2 h后，将栓线抽出约10 mm使CCA内实现再灌注。假手术组麻醉和手术过程同上，但分离血管后不插入尼龙渔线。

1. 5免疫组织化学方法测定层黏连蛋白及MMP－2蛋白按再灌注时间点麻醉大鼠，开胸暴露心脏，先以生理盐水灌注，继之用4%多聚甲醛溶液进行内固定，完整取大鼠脑组织外固定，72 h后进行脱水、石蜡包埋，最后制备冠状切片。链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶( SP)法免疫组化观察MMP－2和层黏连蛋白表达，胞质被染成棕黄色的为MMP－2阳性表达细胞，层黏连蛋白表达于细胞间质，呈条索状棕褐色，观察缺血侧的组织切片上5个不同视野，400倍镜下计数，奥林巴斯相机拍照。

1. 6 EB标本采集与测定各灌注时间点前30 min由舌静脉推注EB溶液( 2 ml/kg)，灌注时间点断头取脑棉纸吸干脑表面水分，电子天平称湿重，每100 mg脑组织加入1 ml二甲基酰胺中，于45℃恒温水浴24 h，离心机1 000 r/min离心10 min，分离出上清液，置于可见光分光光度计(λ= 632)中，测定上清液光密度OD值，二甲基酰胺做空白比色。脑组织EB含量为观察指标:脑组织EB含量(μg/g) =待测样品EB含量(μg/ml)×甲酞胺容量( ml)÷脑湿重( g)，待测样品EB含量根据标准曲线回归方程求得。

2结果

2. 1姜黄素对MMP－2活性的影响假手术组MMP－2在各时间点均低表达，缺血再灌注组MMP－2的阳性细胞数约于24 h开始升高，48 h最明显，姜黄素组发现其可以降低缺血再灌注大鼠脑组织中MMP－2的表达( P＜0．05)，见表1。

表1姜黄素对大鼠MMP-2表达的影响( n=5±s)

表1姜黄素对大鼠MMP-2表达的影响( n=5±s)

与假手术比较: 1) P＜0．05;与缺血再灌注组比较: 2) P＜0．05;下表同

组别　24 h　48 h　96 h假手术组　10．44±0．47　 10．51±0．52　 10．39±0．81缺血再灌注组　24．81±1．221)　35．12±3．011)　30．23±2．921)姜黄素治疗组　19．22±1．852)　30．64±2．862)　25．46±1．992)

表2姜黄素对大鼠层粘连蛋白阳性血管计数的影响( n=5±s)

表2姜黄素对大鼠层粘连蛋白阳性血管计数的影响( n=5±s)

组别　24 h　48 h　96 h假手术组　22．80±1．21　 22．15±0．97　 22．66±1．11缺血再灌注组　16．56±0．921)　12．92±1．131)　14．55±0．971)姜黄素治疗组　19．45±1．062)　16．03±1．962)　18．52±1．822)

2. 2姜黄素对层黏连蛋白表达的影响见表2。与假手术组比较，缺血再灌注组层黏连蛋白血管计数各时间点均减低，48 h相对明显;姜黄素治疗组各时间点层黏连蛋白阳性、微血管计数较缺血再灌注组均有升高( P＜0．05)。

2. 3姜黄素对BBB通透性的影响缺血再灌注组缺血侧脑组织EB含量在24 h开始升高，48 h达到高峰，姜黄素治疗组与缺血再灌注组比较，各个时间点EB含量均明显降低，结果有统计学意义( P＜0．05)，见表3。

表3姜黄素对大鼠EB含量的影响( n= 5±s，mg/g湿重)

表3姜黄素对大鼠EB含量的影响( n= 5±s，mg/g湿重)

组别　24 h　48 h　96 h假手术组　3．06±0．51　 2．98±0．48　 3．11±0．69缺血再灌注组　5．10±0．531)　7．32±0．491)　6．04±0．331)姜黄素治疗组　4．09±0．442)　5．67±0．512)　4．98±0．472)

3讨论

脑缺血再灌注损伤后脑组织水肿的两大病理机制是细胞源性水肿与血管源性水肿，后者主要通过对BBB的完整性的破坏，使血管通透性提高即大分子量的血浆蛋白及水分外渗。多项研究显示:脑缺血再灌注后MMPs的表达增加，其中以MMP－2与再灌注损伤的关系更为密切〔5〕。MMPs是一组锌依赖蛋白酶，MMP－2是MMPs家族中26个成员之一，是一种分子量为92 kD的非糖化胶原酶。神经组织中的MMP－2以无活性前体由血管内皮细胞、胶质细胞和神经元细胞等分泌〔6〕，被蛋白酶切割后激活，其作用为降解脑微血管细胞外基质( ECM)，包括血管基底膜的胶原、层黏连蛋白和纤维连接蛋白等，引起BBB开放，使BBB正常结构破坏、通透性增加，导致血管源性脑水肿的出现。EB溶液进入血液后即与血浆蛋白结合，血浆蛋白不能通过结构完整的BBB，只有在BBB被破坏时结合在蛋白上的EB才能进入脑组织，因此作为指示剂的EB可看做评估BBB损伤程度的定性指标。本研究结果显示:缺血再灌注时间越延长，EB含量与MMP－2活性、层黏连蛋白的表达关系越密切。MMP－2缺血再灌注24 h表达增高，48 h达高峰，96 h表达开始下降;各时间点层黏连蛋白表达与MMP－2呈负相关;而EB含量在24 h升高，48 h最高，96 h开始下降与层黏连蛋白呈负相关。与假手术组相比，缺血再灌注组不同时间点EB含量均明显增高。由此可以推断，MMP－2的活性及BBB基底膜层黏连蛋白表达减少与BBB通透性增加具有相关性。

姜黄素提取自姜黄属药用植物的一类黄色多酚物质。研究证明，其具有抗肿瘤、抗免疫、抗氧化、抗纤维化和抗炎症〔7〕等多重生物学作用。近年来，国内外研究发现姜黄素对脑缺血后的神经损伤具有保护作用。Liu等〔3〕发现姜黄素可以通过抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的表达而起到抗凋亡作用。姜黄素可以降低原代培养神经元缺氧缺糖损伤导致的还原型辅酶Ⅱ高表达，同时启动磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶( PI3K/AKt)信号通路，从而降低神经细胞的损伤〔8〕。本研究结果表明，姜黄素治疗后，各个时间点损伤侧大鼠脑组织MMP－2表达均降低，层黏连蛋白阳性血管数量增加显著，脑组织EB含量下降明显即BBB通透性降低。

综上所述，姜黄素通过对MMP－2活性的抑制作用，减少层黏连蛋白降解破坏、降低BBB通透性、减轻血管源性脑水肿可能是其对抗脑缺血再灌注损伤的机制之一。但姜黄素对脑缺血再灌注损伤的确切保护途径尚需更加深入的研究阐明。

4参考文献

1 Barreto AD．Intravenous thrombolytics for ischemic stroke〔J〕．Neurotherapeutics，2011; 8( 3) : 388－99．

2辛浩琳，郭娜，徐忠信．MMP－2、MMP－9对脑缺血再灌注大鼠紧密连接蛋白影响的实验研究〔J〕．医学理论与实践，2015; 28( 7) : 841－3．

3 Liu ZQ，Xing SS，Zhang W．Neuroprotective effect of curcumin on spinal cord in rabbit model with ischemia/reperfusion〔J〕．J Spinal Cord Med，2013; 36( 2) : 147－52．

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕．Stroke，1989; 20( 1) : 84－91．

5 Liu J，Jin XC，Liu KJ，et al．Matrix metalloproteinase－2－mediated occludin degradation and caveolin－1－mediated claudin－5 redistribution contribute to blood brain barrier damage in early ischemic stroke stage〔J〕．J Neurosci，2012; 32( 9) : 3044－57．

6 Hamacher S，Matem S，Roeb E．Extracellular matrix－from basic research to clinical significance．An overview with special consideration of matrix metalloproteinases〔J〕．Dtsch Med Wochenschr，2004; 129( 38) : 1976－80．

7 Sikora E，Scapagnin IG，Barbagallo M．Curcumin，inflammation，ageing and age－related diseases〔J〕．Immun Ageing，2010; 7( 1) : 1．

8 Scherman D，Desnos C，Darchen F，et al．Striatal dopamine deficiency in Parkinson's disease: role of aging〔J〕．Ann Neurol，1989; 26( 4) : 551－7．

〔2015－12－09修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:娄季宇( 1952－)，男，教授，博士生导师，主要从事脑血管疾病的研究。

基金项目:河南省科技厅科技攻关项目资助( 201303087)

〔中图分类号〕R743. 3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0280-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 011

第一作者:王一凡( 1988－)，女，在读硕士，主要从事脑血管疾病的研究。