体外心脏震波对大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影响

杨文慧　郭　涛杨　莉　华宝桐杨　萍王　钰(昆明医科大学附属延安医院老年病科，云南　昆明　65005)



体外心脏震波对大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影响

杨文慧郭涛1杨莉华宝桐1杨萍1王钰1
(昆明医科大学附属延安医院老年病科，云南昆明650051)

〔摘要〕目的研究体外心脏震波治疗( CSWT)对大鼠心肌梗死后( MI)心肌细胞凋亡及凋亡蛋白的影响。方法结扎大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死模型，随机分为假手术( Sham)组( n = 10)、MI组( n = 10)及CSWT组( n = 10)。CSWT治疗4 w后，取各组心肌样本进行TUNEL检测观察心肌细胞凋亡，Masson染色观察心肌纤维化，Western印迹检测Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表达。结果与Sham组相比，MI和CSWT组心肌细胞凋亡指数及纤维化程度均增高，Bax和Caspase－3表达显著上调，Bcl－2表达明显下调( P＜0．05) ;而CSWT组较MI组，心肌细胞凋亡指数及纤维化程度均降低，Bax和Caspase－3表达下调，Bcl－2则表达上调( P＜0．05)。结论大鼠心肌梗死后心肌凋亡明显增加，体外心脏震波可抑制大鼠心肌梗死后细胞凋亡，减轻左心室纤维化。

〔关键词〕体外心脏震波;心肌梗死;凋亡

1昆明医科大学第一附属医院心内科

第一作者:杨文慧( 1982－)，女，在读博士，主治医师，主要从事冠心病、心律失常的基础及临床研究。

体外心脏震波治疗( CSWT)是一项新兴的缺血性心脏病治疗方法。CSWT通过体外导入低能量机械脉冲，在心肌组织中产生剪切力和空穴效应，促进多种生长因子表达，诱导缺血心肌局部血管新生，从而改善心肌灌注和微循环，减轻缺血性心脏病患者症状并改善其心功能〔1〕。心肌细胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因。减轻和抑制心肌细胞凋亡的发生，可以改善心肌梗死患者的预后。本课题拟探究CSWT对大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响以及相关凋亡蛋白的变化情况。

1材料与方法

1. 1主要仪器和试剂体外心脏震波治疗仪(瑞士STORZ MEDICAL公司，MODULITH SLC)，荧光显微镜(日本Olympus BX53)，小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司，ALCV9)，台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf 5804R)，凝胶成像系统(美国GE ImageQuant LAS 4000)。DeadEnd TUNEL比色法检测系统(美国Promega)，Masson三色染色液(珠海贝索) ; BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo)。Bax、Bcl－2、Caspase－3抗体(德国Millipore)，GAPDH抗体(美国Santa)，辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Thermo)，异氟烷(上海雅培)等。

1. 2实验分组及动物模型构建选取健康雄性SD大鼠30只，体重( 230±35) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司〔SCXK(湘) 2013－0004〕。随机分为假手术组( Sham)、心肌梗死组( MI)和心脏震波治疗组( CSWT)，每组10只。MI和CSWT组建立心肌梗死模型:于左心耳下方1～2 mm处与肺动脉圆锥间结扎大鼠左前降支冠状动脉〔2〕。见心尖处心肌变苍白、搏动减弱为结扎成功。Sham组不行冠脉结扎，其余操作步骤同其他两组。术后，Sham组和MI组仅给予常规饲喂，无其他特殊处理; CSWT组进行体外心脏震波治疗4 w。

1. 3大鼠CSWT CSWT组在建模后第2天开始CSWT，每周1、3、5进行，治疗4 w，共12次。异氟烷吸入麻醉大鼠，仰卧位固定。心脏震波仪探头水囊紧贴大鼠左胸壁心脏搏动处后开始脉冲发放。每次治疗发放200次脉冲，频率60次/min，震波能量0．24 mJ/mm2〔3，4〕。

1. 4 TUNEL比色法检测心肌细胞凋亡大鼠心肌组织切片60℃烤箱中烘烤20 min，二甲苯和乙醇梯度脱蜡和水化，0．85%氯化钠溶液浸洗5 min，PBS浸洗5 min，之后严格按照Dead－EndTMColorimetric TUNEL System试剂盒操作说明进行染色。苏木素复染细胞核。切片干燥后中性树胶封片，显微镜下观察。以细胞核染成棕黄色为阳性。每张切片在梗死边缘区随机取5个高倍镜视野，记录凋亡阳性细胞核数目，计算凋亡指数( AI)，AI( %) =凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。

1. 5 Masson染色检测心肌纤维化大鼠左室心肌4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋。每个心肌组织样品连续切片3张，厚度5 μm。染色前，60℃烤箱中烘烤切片20 min，二甲苯和乙醇梯度脱蜡和水化。按Masson三色染色液说明书进行染色。显微镜下观察，每张切片分别随机选取5个HPFs (×400)进行观察。Image－pro Plus 6．0软件测定心肌胶原容积分数( CVF) = (胶原面积/全视野心肌总面积)×100%。

1. 6 Western印迹检测Bax、Bcl－2、Caspase－3的表达分别取各样本心肌组织20 mg，加入RIPA裂解液，高速电动匀浆器充分匀浆，冰上超声破碎细胞，然后13 000 g、4℃离心5 min，取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白样品加入等体积2×sample buffer，金属浴95℃5 min，冷却后4℃保存。制备SDS－PAGE，每孔蛋白上样量50 μg，经电泳、转膜、封闭后，一抗(抗Bax、抗Bcl－2、抗Caspase－3、抗GAPDH) 4℃孵育过夜。缓冲液洗脱后放入辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育1 h后进行成像。以GAPDH作为内参，Image－Pro Plus 6．0软件测定条带灰度值，进行半定量分析。

1. 7统计学分析采用SPSS13．0统计学软件，计量资料采用±s表示，多样本间比较采用One－Way ANOVA，两两比较采用LSD法。

2结果

2. 1心肌细胞凋亡的分布经TUNEL染色及苏木素复染细胞核后心肌凋亡细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈蓝色。MI组和CSWT组梗死边缘区心肌细胞内出现较多棕色的细胞核碎裂颗粒。MI组和CSWT组心肌细胞凋亡指数均高于Sham组( 29．91±2．96，15．42±1．33 vs 1．30±0．41) %，而CSWT组心肌凋亡指数明显低于MI组( 29．91±2．96 vs 15．42±1．33) %，差异均有统计学意义( P＜0．05)，见图1。

2. 2心肌纤维化程度Masson三色染色使正常心肌染成红色，纤维组织染成蓝色。MI组心肌纤维化较Sham组和CSWT组明显，心肌纤维排列紊乱，胶原沉积明显。CSWT组心室肌间质胶原容积分数( 18．70±13．06) %高于Sham组( 0．31± 0．17) %，但低于MI组( 70．70±12．34) %，差异有统计学意义( P＜0．05)，见图2。

2. 3心肌Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表达Bcl－2蛋白在CSWT 组( 1．08±0．03)和Sham组( 1．02±0．02)中的相对表达量明显高于MI组( 0．10±0．02) ( P＜0．01)。Bax蛋白在CSWT组( 0．65±0．05)与MI组( 1．10±0．10)中的相对表达量均较Sham 组( 0．30±0．01)升高( P＜0．01)，而CSWT组Bax蛋白表达较MI组则显著下降( P＜0．01)。Caspase－3蛋白在CSWT组( 0．30±0．02)与MI组( 1．31±0．12)中的相对表达量均较Sham 组( 0．01±0．00)升高( P＜0．01)，其中CSWT组较MI组显著下降( P＜0．01)，见图3。

图1 TUNEL比色法检测心肌凋亡(×400)

图2 Masson三色染色检测心肌纤维化(×200)

图3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相对表达量

3讨论

缺血缺氧可诱导心肌细胞凋亡，存活心肌数量逐渐减少而出现左心室扩张、收缩功能减退以及左室重构，最终导致心力衰竭〔5〕。缺血缺氧等影响心肌细胞凋亡的因素主要通过死亡受体通路和线粒体通路传递促凋亡信号，激活凋亡相关基因的表达，包括促进细胞凋亡基因( Bax、wp53、和APO－1/Fas等)和抑制细胞凋亡基因( Bcl－2、mpl和ras等)〔6〕。其中，线粒体通路是从线粒体释放细胞色素C开始的，受Bcl－2基因家族调控，包括凋亡抑制基因Bcl－2和凋亡促进基因bax。在急性心肌梗死患者的人体心肌组织样本中可观察到大量凋亡小体，并且伴有Caspase－3高表达和Bcl－2低表达〔5〕。Bax是低氧应激诱导凋亡的上游调控因子，低氧可促进Bax蛋白构象发生改变而被激活，进一步促进细胞色素C从线粒体释放;而Bcl－2则对Bax诱导线粒体释放细胞色素C这一过程起抑制作用。而当细胞色素C从线粒体膜空隙释放至细胞质后可进一步激活下游Caspase－3。Caspase－3是细胞凋亡过程中的关键酶，也是凋亡途径中处于中心地位的执行者，被激活后可通过激活脱氧核糖核酸酶引起DNA降解、细胞凋亡〔7〕。

目前研究认为CSWT是无创的治疗缺血性心脏病的有效方法之一。该治疗系统可释放类似聚焦超声波的低能量机械震荡波，在心肌组织细胞间产生“空穴效应”并形成大量微气泡，微气泡膨胀继而发生非球面性破裂，对周围的心肌细胞形成快速而短暂的剪切力，诱导VEGF及其受体Flt－1、NO、IGF、IL－8等表达上调，在冠脉原有微血管床基础上促进新生血管形成，从而改善缺血心肌的微循环及代谢〔3，8〕，减轻心室重构〔9〕。在慢性心肌缺血动物实验中，观察到CSWT可完全恢复左心室射血分数( LVEF)和室壁增厚率( WT)、局部心肌血流。而在猪急性心肌梗死模型中，CSWT组较对照组明显改善其左心室射血分数〔10〕。临床研究也显示，CSWT可改善冠心病患者心肌灌注和心肌代谢，减轻心绞痛症状、减少硝酸甘油用量、改善心功能、提高运动耐量，并且具有良好安全性〔9，11〕。但CSWT对缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响作用的研究尚少。Yu等〔12〕在体外缺氧环境下培养H9c2细胞诱导细胞凋亡，并给予CSWT处理(最大能量0．12 mJ/mm2，500次脉冲)，结果H9c2细胞凋亡减少，Bcl－2表达明显上调，而Bax和Caspase－3表达下调。在猪急性心肌梗死模型中，CSWT治疗组心肌中Bcl－2的mRNA水平上调，Bax和Caspase－3的mRNA水平下调，并且线粒体氧化应激相关蛋白的表达量也明显降低〔13〕。而在本研究中，我们通过建立大鼠急性心肌梗死模型模拟人体急性心肌梗死的病理过程，后经CSWT治疗4 w，CSWT组心肌凋亡指数及心肌纤维化程度较MI组明显降低;蛋白水平检测凋亡相关基因的表达变化情况发现Bcl－2表达明显上调，而Bax和Caspase－3表达明显下调。结果进一步提示CSWT可通过抑制线粒体通路传递的促凋亡信号，抑制凋亡相关基因的表达，从而减轻缺血缺氧后心肌细胞凋亡及纤维化程度。

心肌梗死发生后，梗死区及其边缘区的心肌细胞由于缺血缺氧的刺激发生坏死和凋亡。另外，由于心功能降低，左室舒张末压升高，室壁张力增高，心脏舒张期机械负荷加重，神经内分泌系统激活，可引起慢性、持续性氧化代谢上调，致氧化负荷增高，激活应激活化蛋白激酶，引起梗死边缘区和非梗死区的心肌细胞凋亡〔14〕。梗死区心肌细胞凋亡是引起左心室收缩功能降低和早期重构的重要因素，而梗死边缘区以及非梗死区的心肌细胞凋亡则主要导致晚期心功能不全和左心室重构〔15〕。本研究中CSWT组心肌梗死边缘区心肌细胞凋亡指数较MI组明显降低，提示CSWT治疗可通过调控凋亡相关基因的表达而抑制细胞凋亡，挽救梗死边缘区缺血缺氧的心肌细胞，从而能减轻左心室收缩功能下降和左心室重构，改善患者远期预后。这与CSWT相关临床研究结果相符。因此，通过CSWT体外无创物理治疗方法阻断凋亡信号转导途径，减少细胞凋亡及迟发性细胞坏死，可能是减少缺血区心肌细胞死亡的一条有效途径。然而，CSWT如何调控凋亡相关基因的表达，其中的信号转导通路仍需进一步深入探究。

4参考文献

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〔2015－10－17修回〕

(编辑李相军)

The effect of cardiac shock wave therapy on apoptosis of cardiomyocytes and apoptosis-related protein expression in rats with myocardial infarction

YANG Wen-Hui，GUO Tao，YANG Li，et al.
Department of Gerontology，Yan＇an Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan，China

【Abstract】Objective To studythe effect of cardiac shock wave therapy ( CSWT) on the apoptosis of cardiomyocytes and apoptosisrelated protein expression in rats with myocardial infarction( MI) and to explore the mechanism of CSWT in ischemic cardiomyopathy．Methods Thirty healthy SD rats were divided into Sham( n=10)，MI( n=10)，CSWT groups ( n=10)．And the MI model was established by permanent ligation of the left anterior descending artery ( LAD)．After 4 weeks of CSWT treatment，myocardial samples from all groups were prepared for TUNEL and Masson staining．The expressions of Bax，Bcl－2 and Caspase－3 were detected by Western blot．Results Compared with those of sham group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were increased obviously in MI and CSWT group．Bax and Caspase－3 expressions were increased，but Bcl－2 expression level was decreased ( P＜0．05)．Compared with those of MI group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were decreased in CSWT group．At the same time，Bax and Caspase－3 expressions were decreased，as well as Bcl－2 expression level was increased ( P＜0．05)．Conclusions Myocardial apoptosis will be deteriorated greatly after MI of rats．However，CSWT could inhibit cardiomyocytes apoptosis and reduce fibrosis in left ventricular following MI．

【Key words】Cardiac shock wave therapy; Myocardial infarction; Apoptosis

通讯作者:郭涛( 1957－)，男，教授，博士生导师，主要从事冠心病、心律失常的基础及临床研究。

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81260027) ;云南省应用基础研究项目( 2014FZ051)

〔中图分类号〕R541. 4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0265-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 004