顺铂通过抑制RIP活性增强rhTRAIL杀伤肺癌A549细胞

许淑芬　王英凯　刘　磊　孙牧男　谭　岩　方艳秋(吉林省人民医院医学诊治实验中心，吉林　长春　130021)



顺铂通过抑制RIP活性增强rhTRAIL杀伤肺癌A549细胞

许淑芬王英凯刘磊孙牧男谭岩方艳秋
(吉林省人民医院医学诊治实验中心，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨顺铂( DDP)通过抑制受体相互作用蛋白( RIP)增强肺癌细胞A549对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体( TRAIL)敏感性的分子机制。方法Western印迹检测顺铂、Nec－1作用A549细胞后RIP的蛋白表达。MTT法检测联合应用DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后A549细胞的生长抑制率。Western印迹检测DDP+ rhTRAIL和Nec－1+rhTRAIL对A549凋亡相关蛋白caspase－8的活化情况。流式细胞仪检测DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后对A549细胞凋亡的影响。结果DDP和Nec－1能显著降低A549细胞中RIP的蛋白水平，DDP、Nec－1联合rhTRAIL可以实现caspase－8的活化，促进rhTRAIL对A549细胞的杀伤作用，凋亡率从( 5．9±4．93) %提高到( 60．5±4．93) %和( 64．1±5．17) %( P＜0．01)。抑制率分别提高到( 65．5±4．93) %和( 76．3±9．52) %( P＜0．01)。结论抑制RIP蛋白活性能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性，有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的应用。

〔关键词〕重组TRAIL蛋白;受体相互作用蛋白;顺铂;非小细胞肺癌

肿瘤坏死因子( TNF)相关的凋亡诱导配体( TRAIL)是一种杀伤肿瘤的细胞因子，是TNF家族成员之一，能够诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无杀伤作用〔1〕。研究发现TRAIL蛋白可以诱导非小细胞肺癌( NSCLC)发生凋亡，但部分NSCLC对 TRAIL显示耐药，限制了TRAIL广泛应用〔2〕。受体相互作用蛋白( RIP)在细胞的凋亡过程中发挥了重要作用〔3〕，在促细胞凋亡的信号转导中，RIP的C末端死亡结构域能与TRAIL受体蛋白相互作用，形成复合物，导致细胞凋亡〔4〕。Nec－1是RIP的高度特异性抑制剂，通过变构抑制RIP1的活性〔5〕。本研究分别应用顺铂( DDP)和Nec－1抑制RIP表达，探讨抑制RIP表达能否增强rhTRAIL蛋白诱导的NSCLC细胞凋亡。

1材料与方法

1. 1主要材料细胞株A549由本室保存;重组rhTRAIL由本室制备纯化〔2〕; IMDM培养基、胰蛋白酶( Gibco公司) ;小牛血清(杭州四季青生物材料公司) ; Nec－1( Calbiochem公司) ;鼠抗人抗caspase－8、鼠抗人抗RIP( BD Pharmingen公司) ;兔抗人βactin单克隆抗体( Santa Cruz公司) ;四甲基偶氮唑蓝( MTT) ( Sigma公司) ;生物素标记的马抗小鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的亲和素(北京晶美公司)。

1. 2 DDP、Nec－1对RIP的抑制复苏NSCLC A549细胞株，采用IMDM培养液(含10%灭活胎牛血清)在37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。常规传代，生长至对数生长期。5× 105个/ml接种于6孔板中，实验分为加入5 μg/ml DDP、10 μg/ml Nec－1、对照A549细胞、培养液四组，作用24 h后，免疫印亦观察A549细胞的RIP蛋白水平。

1. 3 Western印迹检测RIP蛋白表达加入DDP、Nec－1后24 h收集各组A549细胞，用裂解液制备总蛋白，测定蛋白含量并调整浓度为10 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭。加入稀释的小鼠抗RIP工作液，4℃振摇孵育过夜，加入二抗室温下孵育。TBST液洗膜，加入显色剂DAB，室温下显色。以β－actin作为内参照，检测各组细胞RIP蛋白表达情况。

1. 4 MTT法检测A549细胞抑制率将5×105/ml NSCLC A549株细胞分别接种于96孔板，每孔100 μl。分别加入DDP+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白对照组，每组设3平行孔，培养24 h后，加入新配制的5 mg/ml MTT 20 μl，37℃继续孵育4 h，弃上清加入150 μl DMSO溶解，混匀后在490 nm处测定吸光度。

1. 5 caspase－8活化的检测Western印迹测定DDP+ rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白对照组作用A549细胞株后caspase－8活化表达(方法同1. 3)。

1. 6 A549细胞凋亡率的检测取生长状态良好的A549细胞接种于6孔板中，分别加入DDP + rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL作用，培养24 h后收集A549细胞，AnnexinV－FITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1. 7统计学分析采用SPSS11．5软件行t检验。

2结果

2. 1 DDP、Nec－1对A549细胞中RIP表达的抑制蛋白印迹结果显示，DDP、Nec－1作用于A549细胞24 h后，RIP蛋白表达量显著降低(图1)。

1．空白对照; 2．rhTRAIL; 3．DDP+rhTRAIL; 4．Nec－1+ rhTRAIL;图3同图1 DDP、Nec-1对A549细胞中RIP蛋自表达的影响

2. 2 MTT法检测A549细胞增殖抑制率单独应用rhTRAIL作用A549细胞24 h后，细胞生长抑制率仅为( 7．62±0．62) %; Nec－1+rhTRAIL作用24 h后，A549细胞的生长抑制率增加到( 76．3±9．52) %; DDP+ rhTRAIL作用24 h后，A549细胞的生长抑制率为( 65．47±4．93) %。Nec－1+rhTRAIL、DDP+ rhTRAIL均能显著增强rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性( P＜0．01)，Nec－1+rhTRAIL与DDP+rhTRAIL组比较，A549细胞的生长抑制率差异不显著( P＞0．05)，见图2。

2. 3 caspase－8活化的检测DDP、Nec－1均有助于55 kD的caspase－8蛋白活化成为具有催化活性的43 kD caspase－8，促进rhTRAIL蛋白诱导的肿瘤细胞凋亡级联反应，见图3。

图2 DDP联合rhTRAIL对A549细胞增殖的抑制作用

图3蛋自印迹分析A549细胞内caspase-8的表达

2. 4 A549细胞凋亡率的检测DDP + rhTRAIL和Nec－1+ rhTRAIL组的平均凋亡率分别为( 60．52±4．93) %和( 64．12± 5．17) %，显著高于rhTRAIL组的( 5．9±4．93) %，提示抑制RIP表达能促进A549细胞凋亡。

3讨论

TRAIL凋亡疗法被认为是一种极具潜力的抗肿瘤治疗策略。TRAIL蛋白可以有效杀伤NSCLC细胞，但一些TRAIL耐药株的出现制约了其应用〔6〕。TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用主要是通过与细胞表面的受体结合，诱导细胞内凋亡信号通路的活化完成〔7〕。研究证实，在多种耐药细胞株中，某些凋亡抑制基因的过表达是导致凋亡信号终止的重要因素〔8〕。RIP的高表达能够激活I－κB激酶( IKK)复合物，磷酸化I－κB，使其被泛素－蛋白酶体途径降解，并从NF－κB/I－κB异二聚体中脱离。此时，NF－kB活化并可转移到核内，调节其下游的靶基因IL－6、A20等的表达，这些蛋白可以减少细胞凋亡的发生〔9，10〕。

本研究证实，rhTRAIL蛋白作用A549细胞后，caspase－8未能被活化，其诱导A549细胞的凋亡率很低，A549细胞表现出对rhTRAIL蛋白耐药;联合应用DDP及RIP抑制剂Nec－1均可有效下调RIP的表达，同时，caspase－8裂解带出现，说明DDP联合TRAIL作用A549细胞是通过下调RIP蛋白并活化caspase－8蛋白、激活了细胞内的凋亡信号通路来实现的。综上所述，RIP参与了DDP联合rhTRAIL诱导NSCLC细胞的凋亡，使caspase－8蛋白表达活化，凋亡信号通路开放，促进了rhTRAIL蛋白对A549细胞的生长抑制作用，为更好地开展TRAIL治疗NSCLC提供了实验依据和理论基础。

4参考文献

1 Parkin DM，Brav F，Ferlay J，et al．Global cancer statistics，2002〔J〕．CA Cancer J Clin，2005; 55( 2) : 74－108．

2刘磊，方艳秋，谭岩，等．重组可溶性TRAIL表达及诱导A549 和H460wt细胞凋亡〔J〕．吉林大学学报(医学版)，2008; 34( 2) : 270－3．

3 Declercq W，Vanden Berghe T，Vandenabeele P，et al．RIP kinases at the crossroads of cell death and survival〔J〕．Cell，2009; 138( 2) : 229－32．

4 Festjens N，Vanden Berghe T，Cornelis S，et al．RIP1，a kinase on the crossroads of a cell's decision to live or die〔J〕．Cell Death Differ，2007; 14( 3) : 400－10．

5 Degterev A，Hitomi J，Germscheid M，et al．Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins〔J〕．Nat Chem Biol，2008; 4 ( 5) : 313－21．

6 Sun SY，Yue P，Zhou JY，et al．Overexpression of BCL2 blocks TNF－related－apoptosis－inducing ligand ( TRAIL)－induced apoptosis in human lung cancer cells〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2001; 280( 3) : 788－98．

7 Ashkenazi A，Pai RC，Fong S，et al．Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand〔J〕．J Clin Invest，1999; 104( 2) : 155－62．

8 Kim YS，Jin，HO，Seo SK，et al．Sorafenib induces apoptotic cell death in human non－small cell lung cancer cells by down－regulating mammalian target of rapamycin mTOR－dependent survivin expression〔J〕．Biochem Pharmacol，2011; 82( 3) : 216－26．

9 Tomasella A，Blangy A，Brancolini C．A receptor interacting protein 1 ( RIP1)－independent necrotic death under the control of protein phosphatase PP2A that involves the reorganization of actin cytoskeleton and the action of cofilin－1〔J〕．J Biol Chem，2014; 289: 25699－710．

10 Zhang YF，He W，Zhang C，et al．Role of receptor interacting protein ( RIP) 1 on apoptosis－inducing factor－mediated necroptosis during acetaminophen－evoked acute liver failure in mice〔J〕．Toxicol Lett，2014; 225: 445－53．

〔2015－11－12修回〕

(编辑郭菁)

通讯作者:谭岩( 1956－)，男，博士，博士生导师，主要从事肿瘤生物治疗的临床及基础研究。

基金项目:吉林省卫生厅资助项目( 20082036)

〔中图分类号〕R734. 2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0276-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 009

第一作者:许淑芬( 1962－)，女，主任技师，主要从事免疫与分子生物学技术研究。