液相色谱-串联质谱法检查中药制剂中非法添加那红地那非化学成分的研究

隋　译(鸡西市食品药品检验检测中心食保化室，黑龙江 鸡西　158100)



液相色谱-串联质谱法检查中药制剂中非法添加那红地那非化学成分的研究

隋译*(鸡西市食品药品检验检测中心食保化室，黑龙江 鸡西158100)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.02.019

摘要目的：采用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)准确确证中药制剂中非法添加那红地那非化学成分的方法。方法：LC-MS/MS用理化反应法初筛成阳性的药物后再应用，技术对四种可能有非法添加那非类化学药品的中药制剂进行筛查，与那红地那非对照品的一二级质谱图进行比较。结果：在样品质谱图中有与对照品一致的一级质谱峰与二级质谱峰。结论：应用LC-MS/MS法可快速准确鉴定出中药制剂中是否含有非法添加的那红地那非。

关键词LC-MS/MS； 非法添加； 那红地那非

Chemical Constituents of Hongdenafil Illegally Added in Traditional Chinese Preparation by LC-MS/MS Method

SUI Yi(Food, Health Care Product and Cosmetics Administration Room，Jixi Food and Drug Testing Center，Heilongjiang Jixi 158100，China)

ABSTRACTOBJECTIVE：High-performance liquid chromatography-mass spectrometry was adopted，method of traditional Chinese preparation was accurately confirmed. METRHODS：Physical and chemical reaction method was used to screening drugs in positive，and then LC-MS/MStechnology was used to screen 4 kinds of traditional Chinese preparation with illegal addition of hongdenafil；meanwhile，comparison was conducted between grade one and two spectrogram of control group and hongdenafil group. RESULTS：There were two peaks(grade one peak and grade two peak) in the mass spectrum of the sample that accorded with the control group. CONCLUSIONS：The application ofLC-MS/MStechnology can quickly and accurately identify if there is hongdenafil illegally added in traditional Chinese preparation.

KEYWORDSLC-MS/MS； Illegal addition； Hongdenafil

中药对一些慢性病和疑难杂症具有特殊疗效且不良反应少，近年来很受患者的喜爱，但缺点是起效慢，服用时间长。在中药制剂中擅自非法添加功效相似的化学药物，成为不法分子牟取暴利的手段之一。在补肾壮阳类中药制剂中，很多不法分子经常会添加那非类及他达拉非类化学成分，达到药物起效快的效果。笔者先是按照标准[1]对选取的补肾壮阳类中药制剂进行初步理化筛选试验，再应用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法鉴定补肾壮阳类中药制剂中非法添加的那非地那非。 LC-MS/MS联用从保留时间和质谱行为两方面判断中药中是否掺入了化学药，质谱信息能提供丰富的化学结构信息，且方法便捷、准确，专属性强，灵敏度高[2]。采用 LC-MS/MS法鉴定中药制剂中非法添加的那红地那非，可以更好的控制在消肿止痛类中成药中的质量，保证临床用药。

1材料

1.1仪器

Agilent6430三重串联四极杆液质联用仪(美国安捷伦公司)。

1.2试剂

乙腈(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号：124984)；乙酸铵(HNO3优级纯)、乙酸(H2O2优级纯)；试验用水为超纯水(屈臣氏蒸馏水)。

1.3药品

1.3.1对照品：那红地那非(中国药品生物制品检定所，批号：1097-037A3，含量：100%)。

1.3.2样品：参茸三肾胶囊(吉林省俊宏药业有限公司，批号：20130201)；壮腰健身丸(广东省罗浮山白鹤制药厂，批号：1401017，1307029，1401010，1401008，1401010，1404013)；壮腰健肾片(广东逢春制药有限公司，批号：140702)；补肾强身胶囊(吉林省健健今药业股份有限公司，批号：20130303，20120305)。

1.4样品处理

1.4.1样品初筛的处理方法：取胶囊2粒(片剂1片；丸剂为每次服用量的1/5)，片剂、丸剂预先研细或剪碎后，加3%硫酸溶液8 ml，强力超声5 min，静置5 min后，滤过，取续滤液2 ml,滴加0.04 mol/L高锰酸钾溶液，至溶液出现的紫红色在15 s不褪色，静置片刻后，带紫红色褪去至无色或浅棕色，滴加饱和的三硝基苯酚饱和溶液6滴，若3 min内出现黄色浑浊，静置后形成黄色沉淀物，即为样品中含有那非类化学成分。这10批样中有3批出现阳性反应，证明里面含有那非类化学成分。本试验就取这3批样品进行最后的确证试验。

1.4.2供试品溶液的制备：精密称取1次服用量，研细后转移至50 ml量瓶中，加乙腈40 ml，超声处理20 min，冷至室温用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。精密量取续滤液5 ml至25 ml容量瓶中，再精密量取续滤液5 ml至25 ml容量瓶中用50%乙腈稀释，摇匀即得。

1.5对照品处理

对照品溶液的制备：取那红地那非对照品10 mg，置50 ml容量瓶中，用乙腈溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取续滤液5 ml至25 ml容量瓶中，用50%乙腈稀释，再精密量取续滤液5 ml至50 ml容量瓶中摇匀即得(稀释制成每1 ml含4 μg 的溶液)。

1.6其他

所用玻璃器皿均以10%硝酸溶液浸泡24 h以上，用水反复冲洗，最后用超纯水冲洗干净，阴干备用。

2方法与结果

2.1仪器工作条件

2.1.1色谱条件：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；检测波长为230 nm；以含0.05%乙酸的0.025 mol/L乙酸铵溶液∶乙腈溶液(V∶V=84∶16)为流动相A，甲醇为流动相B按下表1洗脱。

2.1.2质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)，毛细管电压5.5 KV，离子源温度400 ℃，离子源喷雾气流速800 ml/min,正离子检测方式，扫描方式为全扫描一级质谱、全扫描二级质谱，扫描范围50～600 amu。

表1　梯度洗脱的时间与各流动相之间的比例

2.2测定法

分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 μl注入液质联用仪，记录液相色谱图、一级质谱图和二级质谱图。采用比较供试品与对照品的一级质谱图和二级质谱图的方法进行定性、定量分析，确定供试品中添加的化学成分，见图1。

2.3线性关系试验

精密称取那红地那非对照品溶液(每1 ml含4 μg 的溶液)0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 ml分别置50 ml量瓶中以流动相稀释至刻度,精密量取各浓度对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以样量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算回归方程为Y=4.2E+5X-5 773.3，r=0.999 2 结果进样量在0.05～8.0 μg/ml时峰面积积分值呈良好的线性关系，见表2和图2。

表2　线性关系表

2.4灵敏度试验

图1　LC-MS/MS法测定补肾壮阳类中药制剂中非法添加那红地那非化学成分的的一级质谱图和二级质谱图Fig 1　Grade one and two spectrogram of traditional Chinese preparation for reinforcing kidney to strengthen yang with application of LC-MS/MS technology

图2　线性关系图Fig 2　Linear relationship diagram

取对照品溶液“1.3.1”适量，加50%乙腈逐步稀释，按“2.2.1”“2.2.2”项下条件测定，上述药物的待测量在1～50 ng之间时，选择离子监测(SIM)质谱峰信噪比(S/N)在3左右[3]。

2.5精密度试验

在所选定测试条件下，以浓度为4 μg/ml的那红地那非对照品溶液为考察对象，重复进样6次进行精密度试验，测得RSD=1.7%，表明该分析方法精密度良好。

2.6加样回收率试验

准确称取样品壮腰健肾丸(批号为：1401017)，3.5 g/份，共3份，按“1.2.2”项处理后，按“2.2.1”项条件检测后，然后在样品中按照低、中、高浓度分别加入标准样品0.05、0.2、0.8 μg，做回收率试验。结果表明样品壮腰健肾丸加标回收率分别为100.05%、104.07%、101.15%，RSD为1.5 %。

2.7测定结果

中药制剂中非法添加那红地那非化学成分的测定分取研磨好的壮腰健身丸批号为：1401017，1307029，1401010，1401008共4份(n=4)按“1.2.2、1.3.1、2.2.1、2.1.2”的项下方法，测定编号为样1、样2、样3、样4的样品中，结果比较供试品与对照品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图的方法进行定性分析，确定供试品中未添加的化学成分那红地那非。

3讨论

本研究中10批样品，经过化学方法筛选，甄别出3批样品含有黄色浑浊，静置后有沉淀物生产。经过用液质联用仪器分析后，证明该样品中并未含有那红地那非成分，应该是含有别的那非类成分，该试验专属性和针对性强，参考论文[4-17]，LC-MS/MS可以做为补肾壮阳类中药制剂中含有那非类化学药物例如那红地那非，最后确证的试验手段。

LC-MS/MS法是对药物未知成分进行定性分析的有利手段。但是，当色谱分离效果差的时候会制约LC-MS/MS的分析效果。因此通常情况下，当两个化合物未充分分离而形成部分重叠峰的时候，为了获得明确的质谱信息，必须改变当前色谱条件以实现较充分的色谱分离[18]。在该试验中原标准[1]使用的流动相进行了相应的调整，因为现在只是测定一种那非类物质，原标准中乙腈与甲醇还有乙酸铵溶液都单独放在不用的流动相瓶中调比例进行梯度洗脱。笔者将乙腈与乙酸铵溶液互溶后在与甲醇按比例进行梯度洗脱后，在加样回收试验中可见该方法样品质谱图干扰小、更稳定，分离效果理想。

由于那红地那非的出峰时间约为10 min左右，所以只单一测定那红地那非的流动相洗脱时间参考那非类的对照品出峰时间可以相应缩短流动相时间。

由于该试验是有标准物质的专属试验，结果判定则单从保留时间上，便可判定出样品含不含有该物质，无需查看每个峰所对应的棒状图。在保留时间一致的情况下，则打出棒行图进行碎片子离子的最后判定，会更直观。

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(收稿日期：2015-07-08)

中图分类号R943

文献标志码A

文章编号1672-2124(2016)02-0193-03

*副主任药师。研究方向：药品的质量控制和分析。E-mail:122502654@qq.com