益生菌乳酸发酵法生产高纯度低聚异麦芽糖

许宏贤， 张晓萍， 段 钢

（杜邦工业生物应用科技部 杰能科（中国）生物工程有限公司，江苏 无锡 214028）

益生菌乳酸发酵法生产高纯度低聚异麦芽糖

许宏贤， 张晓萍， 段 钢*

（杜邦工业生物应用科技部 杰能科（中国）生物工程有限公司，江苏 无锡 214028）

研究了一种新的高纯度低聚异麦芽糖（IMO）生产方法。利用益生菌添加甜菜碱进行乳酸发酵，将可发酵性糖葡萄糖、果糖和麦芽糖转化为乳酸，使原料IMO等级由IMO-50提高到IMO-90，发酵液无需进行菌体分离即可用于食品加工。

低聚异麦芽糖（IMO）；乳酸；益生菌；甜菜碱

低聚异麦芽糖（Isomalto-Oligosaccharides，简称IMO）是功能性低聚糖的一种[1]，又称分枝低聚麦芽糖、异麦芽低聚糖、异麦芽寡糖，是指葡萄糖基以α-1，6糖苷键结合而成单数糖在2~6不等一类低聚糖，主要是玉米淀粉在α-淀粉酶和转葡萄糖苷酶的作用下通过一系列反应得到[2]，使含异麦芽糖（Isomaltose，IG2）、潘糖 （Panose，P）、异麦芽三糖（Isomaltotriose，IG3）以及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖。低聚异麦芽糖是一种酵母和乳酸菌难以利用的糖类，用于面包、酸奶等发酵食品时不能被酵母菌、乳酸菌发酵利用，它残留在食品中发挥其各种理化性能和抗龋齿性，同时促进肠道内双歧杆菌的发育。低聚异麦芽糖在发酵乳制品中不会妨碍正常乳酸菌发酵，低聚异麦芽糖的不发酵性是其在食品中发挥保健功能的前提基础[3]。GBT20881-2007表明商品低聚异麦芽糖产品规格主要有两种剂型即糖浆和糖粉；两种规格即IMO-50型和IMO-90型[4]。IMO-50型含有一定量的葡萄糖、麦芽糖；而IMO-90型含葡萄糖和麦芽糖较少，是高纯度产品。典型的酶法IMO生产工艺流程如图1所示。

乳酸，学名为α-羟基丙酸、2-羟基丙酸、丙醇酸，其化学式为C3H6O3，相对分子质量 90.08。乳酸是一种重要的有机酸，广泛存在于人体、动植物及微生物中。乳酸是一种风味物质，同时乳酸、乳酸盐及其衍生物广泛应用于食品、医药、酿造、纺织等领域。L-乳酸的工业化生产我国多采用细菌发酵[5]。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌总称，它的自然宿主是人类、动物和植物[6]。益生菌是指通过摄入适当量从而对宿主产生有益作用的活性微生物。益生菌对人体主要具有免疫调节、调整肠道菌群、防止腹泻、降低粪便中某些酶活性及抗突变抗癌的医疗保健作用。最常见的益生菌主要有Bifidobacterium和Lactobacillus属[7]。

甜菜碱是一种季铵型生物碱，生产方法有两种[8]。一种是从甜菜制糖废液中回收，另一种是化学合成，甜菜碱在化工、印染、日化、医药、食品、饲料等领域中都有广泛的应用，用它制造人造肉等食品，对老人保健、儿童生长发育都能起到良好的促进作用。作为一种高效活性甲基供体生物营养素，甜菜碱具有多种生理功能，如促进动物蛋白质和脂肪代谢、调节渗透压、稳定维生素、改善饲料适口性等。

低聚异麦芽糖酶法工艺生产的糖浆如果不经过专门的去除葡萄糖、麦芽糖的过程，其IMO质量分数一般不会超过60%。

根据国标GBT20881-2007，IMO-90中葡萄糖和麦芽糖的含量不高于10%，是高纯度产品，高纯度低聚异麦芽糖具有特殊的生物活性功能，甜度低、热值低、抗龋齿，促进人体肠道内双歧杆菌大量繁殖，明显抑制肠道内有害菌的繁殖及腐败物质的生成，具有防止便秘、增强机体免疫力等功效，更适宜糖尿病人和肥胖症患者等人群食用，从而扩大了IMO的应用范围。利用发酵法去除可发酵性糖从而提高功能性低聚糖含量的研究近年开始见诸报道[9-10]，相关的研究有利用乳酸菌发酵法生产高活性大豆低聚糖[11-12]；利用酵母菌生产高纯度低聚异麦芽糖联产酒精等[13-15]；而少量残余酒精可能影响产品的风味；但是在商品IMO-50的基础上，通过乳酸菌发酵从而提升IMO等级的研究尚未见报道，IMO浓缩糖浆的高渗透压可能是影响乳酸发酵的技术障碍之一。作者研究了通过添加甜菜碱进行益生菌发酵，将葡萄糖和麦芽糖转化为乳酸，从而提高IMO的等级，该技术无需进行发酵液菌体分离，有着广泛的应用前景和巨大的商业潜力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

IMO-50糖浆：作者所在实验室制备；甜菜碱Betafin BP20：杜邦工业生物应用科技部提供；菌种：Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2446：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；Lactobacillus plantarum CICC 20659：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

分析试剂：乳酸，葡萄糖，果糖，麦芽糖，麦芽三糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，异麦芽四糖，异麦芽五糖，异麦芽六糖，异麦芽七糖，潘糖，海藻糖，麦芽酮糖，曲二糖，黑曲霉糖：Sigma-Aldrich公司产品；醋酸钠（ICS级）：Fisher公司产品。

基础液体培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，柠檬酸氢二铵2，无水乙酸钠5，葡萄糖20，Tween 80 1，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4· H2O 0.05，CaCO320，自来水配制，pH 6.5，基础固体培养基加入质量分数2%琼脂粉；121℃灭菌20 min。

发酵培养基（g/L）：玉米浆40，酪蛋白10，牛肉膏 10，酵母膏 10，Tween 80 1.5，MnSO4·H2O 0.3，CaCO320，用实验室自己制备的IMO-50配制，pH 6.5，根据试验条件不同添加甜菜碱。

1.2 实验设备

高压液相色谱：Agilent 1100系列，Agilent公司产品；离子色谱（IC）：ICS-5000型离子色谱：戴安公司产品。1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌活化与扩培 从斜面上取一环乳酸菌，转移到装有100 mL液体基础培养基的500 mL三角瓶中，37℃摇床200 r/min培养12~18 h。

1.3.2 乳酸发酵实验步骤 配制发酵培养基，装液量每个发酵罐1 000 mL。打开Bio-Command Plus软件，控制温度45℃；根据试验条件不同用氨水或氢氧化钙调节pH 6.5。按接种量体积分数10%接入培养好的液体种子，开始发酵，过程中控制pH温度稳定。发酵过程中取样进行HPLC分析乳酸含量和残余葡萄糖、二糖含量。发酵结束取样进行IC分析IMO组成。

2 结果与讨论

2.1 甜菜碱添加量的影响

考虑到IMO-50糖浆的高渗透压，而甜菜碱可以调节乳酸发酵渗透压[18]，故首先考察甜菜碱不同添加量对发酵的影响。试验菌种为L.rhamnosus CGMCC 1.2446，20%氨水调节pH，将不同含量的甜菜碱加入到发酵培养基中培养，定期取样，采用HPLC测定发酵液中乳酸和残余一糖二糖的质量分数，结果如图2所示。糖含量较高；添加甜菜碱后情况明显好转，高添加量3 g/L优于低添加量1 g/L；由图3可知，在不添加甜菜碱或甜菜碱添加量不足的情况下，乳酸含量较低，与图2残糖降低水平相呼应。相关研究表明，在高渗环境下细胞的生长速率和酶活会大幅下降，甜菜碱作为一种外源性的渗透保护剂，可以平衡细胞内外的渗透压，从而提高微生物对高渗环境的耐受性；对于乳酸菌Lactobacillus，甜菜碱还是酶活的渗透压保护剂。由于IMO-50糖浆的干物质量分数高达，试验结果再次证明了如果用IMO-50糖浆直接进行发酵，必须添加适量的甜菜碱。

2.2 氢氧化钙质量分数的影响

在工业化规模乳酸发酵生产中，氢氧化钙是最普遍使用的pH调节剂，故考察不同质量分数氢氧化钙对发酵的影响。试验菌种 L.rhamnosus CGMCC 1.2446，将3 g/L甜菜碱加入到发酵培养基中培养，用20%或8.5%氢氧化钙溶液调节pH，定期取样，采用HPLC测定乳酸含量和残余一糖二糖的变化，结果见图4和图5。

由图2可知，在不添加甜菜碱的情况下，在发酵的前17 h，残余的一糖二糖几乎没有变化，发酵的延滞期非常长，发酵几乎处于停滞状态，最终残

由图4可知，质量分数8.5%和20%氢氧化钙的最终残余一糖二糖数值几乎没有差别，图5表明8.5%的最终乳酸含量略高于后者，发酵过程中前者的产酸速率略快于后者，这可能是由于低质量分数的氢氧化钙有一定的稀释作用所致。由于HPLC显示残余的一糖含量接近零，二糖仍有部分残余，而HPLC无法分辨残余二糖的具体成分，故选取质量分数20%氢氧化钙的发酵液与原始糖浆进行IC分析，结果如表1所示。

由表 2可知，通过 L.rhamnosus乳酸发酵，IMO-50糖浆一糖中的葡萄糖从 78.66 g降低到0.11 g，果糖含量从3.49 g降为零；二糖中的麦芽糖从7.29 g降低到3.68 g；异麦芽糖、黑曲霉二糖、麦芽酮糖略有下降，海藻糖和曲二糖变化不大；三糖及三糖以上成份变化不大。即通过L.rhamnosus乳酸发酵，可发酵性糖（葡萄糖、果糖、麦芽糖）大幅降低，从39.1%降低到3.1%；由于L.rhamnosus属于益生菌，也会代谢某些低聚糖成份转化为乳酸，如异麦芽糖、黑曲霉二糖和麦芽酮糖等，但利用顺序靠后；总体来讲，发酵前总糖为228.96 g，发酵后为122.14 g，有106.82 g糖通过L.rhamnosus转化为103.45 g乳酸。发酵液是高纯度IMO糖浆（可发酵性糖含量仅为3.1%）、乳酸和L.rhamnosus的混合物。

2.3 其它益生菌的发酵

试验菌种L.plantarum CICC 20659，将3 g/L甜菜碱加入到发酵培养基中培养，用质量分数20%氢氧化钙调节pH，定期取样，采用HPLC测定乳酸含量，结果如表2所示；采用IC测定发酵前后IMO成份变化，结果如表3所示。

由表 3可知：通过 L.plantarum乳酸发酵，IMO-50糖浆一糖中的葡萄糖从105.28 g降低到0.09 g；二糖中的麦芽糖含量从24.7 g降低到4.09 g；海藻糖从3.67 g降低到0.23 g，异麦芽糖从48.02 g降低到26.78 g，曲二糖、黑曲霉二糖略有下降，麦芽酮糖未见降低；三糖中麦芽三糖从3.34 g降低到0.78 g，潘糖从32.06 g降低到17.21 g，异麦芽三糖含量未见降低。即通过L.plantarum乳酸发酵，可发酵性糖（葡萄糖、麦芽糖）大幅降低，从49.17%降低到3.98%；由于L.plantarum属于益生菌，也会代谢某些低聚糖成份转化为乳酸，如异麦芽糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉二糖、潘糖等；总体来讲，发酵前总糖为264.35 g，发酵后为104.97 g，有159.38糖通过乳酸菌L.plantarum转化为145.73 g乳酸。发酵液是高纯度IMO糖浆（可发酵性糖含量仅为3.98%）、乳酸和益生菌L.plantarum的混合物。

比较表1和表3可知，不同的益生菌如L. rhamnosus，L.plantarum进行IMO乳酸发酵，尽管其最终发酵液中IMO的成分不尽相同，但是其可发酵性糖（葡萄糖、果糖、麦芽糖）的质量分数都低于4%，从而使IMO-50的等级提高到IMO-90，当然由于益生菌本身可以利用某些低聚糖成份，如何及时判断和控制发酵终点尚值得进一步探讨。

3 结语

低聚异麦芽糖是一种集营养、保健、疗效于一体的功能性低聚糖。益生乳酸菌因为与人类健康息息相关而日益备受关注。作者提供的方法所得发酵液中所含成分（IMO，乳酸，益生菌）均是可食用成分，发酵液无需进行菌体分离即可用于食品加工。

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Production of High-Purity IMO by Lactic Acid Fermentation Using Probiotics

XU Hongxian， ZHANG Xiaoping， DUAN Gang*
（DuPont Industrial Biosciences，Genencor（China）Bio-Product Co.，Ltd.Wuxi 214028，China）

A new method for the production of high-purity isomalto-oligosaccharides（IMO）by the lactic acid fermentation using probiotic strains was demonstrated.With the addition of betaine and the fermentation of sugars such as glucose，fructose and maltose into lactic acid by probiotics，the low-purity IMO-50 was effectively converted into the high-purity IMO-90.There was no need to separate the strains after conversion.The method is an easy way to manufacture edible products.

Isomalto-Oligosaccharides（IMO），lactic acid，probiotic strain，betaine

Q 815

A

1673—1689（2016）11—1219—05

2015-01-18

许宏贤（1970—）女，江苏无锡人，工学硕士，高级工程师，主要从事食品与发酵工程研究。E-mail：xuhongxian@hotmail.com

*通信作者：段 钢（1966—），男，辽宁沈阳人，工学博士，亚太地区技术总监，主要从事工业酶应用与开发研究。E-mail：gang.duan@dupont.com